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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖 犜 代替 猪繁殖和呼吸综合征检疫规范犙犲狀犻狋犪狀狉犪狌狆犾狉狅犮狅犳狋狅狉狆犲狀犻犲犮狉狅狆犲狏犻犪狀狋犱犮狅犱狌狉狊犲狉狆狉狅狋犪狉犻狔 狊狔狅狀狉犱犿犲 发布 实施中华人民共和国发 布国家质量监督检验检疫总局犜 犛犖前 言本标准代替 猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验和 猪繁殖和呼吸综合征免疫过氯化物酶单层试验。本标准的附录 、附录 、附录 和附录 是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫 局 、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起
2、草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、苏永生、简中友、袁文泽、赵祥平、董志珍。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ； 。猪繁殖和呼吸综合征检疫规范 范围本标准规定了猪繁殖和呼吸综合征（）的检疫规范。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的病毒分离鉴定、病毒抗原监测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。 凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而 ，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 猪繁殖和呼吸综
3、合症诊断方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。免疫过氧化物酶单层试验 犻犿犿狌狀狅狆犲狊犱犪犻狓狅狉犪犲犿犾狅狀狅狔狉犪犲狊狊犪狔 （犐犘犕犃）培养的单层细胞，接种病毒或处理过的被检样品，让 细胞感染，经组织固定和内源酶处理，加被检血清 或 阳 性 抗 体 处 理，再 加 酶 标 抗 抗 体，经 过 显 色 反 应 检 测 抗 原 或 抗 体 的 存 在。 在诊断上最早用于检测其抗体。 间接免疫荧光试验犫犱狅狋犻狀犲犮狋狊犪狀犲狉狅狌狋犾犮犲犳狉犻狀犱犻狔狋狊犲狋（犐犉犃）成切片或涂片的标本经过固定后，加抗血清处理，再加荧光标记的抗抗体染色，漂洗，滴加缓冲甘油后用盖玻片封载，用荧光显微
4、镜进行检测。 检测抗体，可用于早期诊断。 疾病概述猪繁殖 和 呼 吸 综 合 征（ ，）， 也 称 为 蓝 耳 病（）， 是由 猪 繁 殖 和 呼 吸 综 合 征 病 毒（ ，）引起的以母猪繁殖障碍和仔猪及育成猪呼吸困难为特征的接触性传染病。 繁殖障碍的特征是流产、死胎和产弱仔，弱仔由于呼吸道疫病和继发感染常常很快死亡；呼吸道特征是仔猪及育成猪呼吸困难，年龄较大的猪可能出现温和性呼吸道症状，有时因继发感染而使病情复杂。 其病原、流行 病学、诊断以及检疫与诊断参见附录 。 检疫方法 病毒的分离与鉴定（见 ） 设备、材料和试剂 器材：孔或孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温箱、普通冰
5、箱及低温 试剂：培养液、犊牛血清、青霉素（ ）与链毒素（碳酸氢钠溶液等。冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径 的微孔滤膜、普通光学显微镜。 ）溶液、犛犖 犜 细胞：猪原代肺泡巨噬细胞培养物（）或 猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法参见附录 。 提供。 样品的采取和送检或 细胞。 由无或 细胞由国家指定单位在发病早期，无菌采取病猪的血清或腹水。 对病死猪（如流产的死胎）和扑杀猪（如弱胎猪）， 应立即采取肺、扁桃体和脾等组织，置 保存，立即送实验室检疫。 不能立即送检者，应置 冰 箱中，或加甘油生理盐水， 保存送检。 样品的处理血清和腹水可直接使用。 肺 、脾和扁桃体等组织经处理后可单独使
6、用，也可混合使用。 各组织剪碎后研磨成糊状，加入培养液，制成悬液，犵 离心 ，吸取上清液，加入青霉素 、链霉素 、庆大霉素 和两性霉素 。 怀疑有细菌污染的样品，可用 操作方法 微孔滤膜过滤处理。 稀释样品取细胞培养板 每 孔 加 入 细 胞 培 养 液（含 犊 牛 血 清、青 霉 素 、链 霉 素 、两性霉素 、 ） ，在 和 孔内加入同一份已处理的样品各 （样品倍稀释）。将板轻轻摇动后，从 和 排孔各取 分别移入和 排孔内（样品倍稀释）。除第 列和第列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。 振动稀释板后加盖 ，置 冰箱内保存备用。 制备细胞板已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离
7、物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应首选细胞，先将细胞泥用细胞培养液稀释，使细胞终浓度为 个 ，或将 或 细胞用营养液稀释，细胞终浓度 个 。 然后，在另一换孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液 ，于 二氧化碳恒温培养至形成单层细胞。按照上述操作，每板可检测份样品，每份样品重复两个滴度。 第 列和第列留作正常细胞对照 （不接种样品）。 接种样品由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液 ，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内（第 一代）。细胞板加盖后 ，放入 二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变作用（）， 连 续观察 。通常在接种后 内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱
8、落 。 培养物盲传根据第一代培养物出现的情况（通常在接种后的第 ）安排盲传。 盲传时，不论有无，一 律 各 取 孔 内 混 悬 液 ，移 入 新 细 胞 板 相 应 的 孔 内。 再 于 二 氧 化 碳 恒 温 箱 培 养 ，每天观察。 结果的判断和解释在第二代培养结束时，不论是否出现，对所有的孔应采用免疫过氧化物酶单层试验（）或间接免疫荧光试验（）进行终判；其结果呈现阳性反应的，则被认定为病毒分离阳性。 免疫过氧化物酶单层试验（犐犘犕犃）（ 见 ） 材料准备 器材：微量移液器、倒置显微镜等。 试剂：诊断板的制备参见附录 ；标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供，使用前按说明书规定稀释至工作浓度；洗涤液、血清稀释液和显色 底物溶液参照附录 自行配制。犛犖 犜 样品：采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无 污 染，密 装 于 灭 菌 小 瓶 内。或 冰箱保存或立即送检。 试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作倍稀释。 操作方法 取已作倍稀释的被检血清加入诊断板同一排相邻的 个病毒感染细胞孔（）和其后的 个未感染细胞孔（）内 ，每孔 ，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以 血清稀释液代替血清设立空白对照，封板并于条件下过夜。 弃去板中液体，用洗涤液洗板 次 ，每孔 ，每次拍干。 ，最后在吸
