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1、原子力显微镜原子力显微镜（Atomic Force Microscope, AFM）起源于扫描隧道显微镜技术，属于扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope, SPM）家族中的一种。它广泛应用于生物、物质结构、分子生物学等领域，在蛋白单分子结构与功能研究中得到广泛地应用朱杰，孙润广. 原子力显微镜在蛋白单分子结构与功能研究中的应用J. 分析化学, 2006, 34(5): 735-740.。和经典的透射电镜相比，AFM不受成像环境限制、无需采用重金属喷涂或染色来提高成像反差，并且分辨率高。AFM与传统的X射线衍射、核磁共振、旋光色散等方法相比，具有分辨率高、制样简单以及
2、在保持生物活性下成像等优点。1.1 AFM的原理AFM通过探测探针与被测样品之间微弱的相互作用力(原子力)来获得物质表面形貌的信息，分辨率可达原子级水平。AFM采用显微制作的探针扫描待测样品表面，探针被固定在一根有弹性的悬臂的末端，悬臂通常由金和硅的材料制成。探针在样品表面扫描时，测量探针与样品之间的相互作用力，随着针尖与样品表面之间距离的不同，相应产生微小的作用力，就会引起悬臂的偏转。反馈电路通过控制扫描头在垂直方向上的移动，使扫描过程中每一点( x, y)上探针和样品之间的作用力保持恒定;当激光束照射在悬臂的末端，经反射进入光电检测器。针尖与样品表面的距离不同使得激光束的方向发生改变，这就
3、使光电检测器接收到的信号变化，送入计算机的电脉冲也产生相应的变化，检测器将反射的激光束转化成电脉冲，电脉冲信号经过计算机处理，然后计算机将这些信息转换成或明或暗的区域，这样扫描头在每一点( x, y)上的垂直位置被记录，作为样品表面形貌成像的原始数据，从而产生了有明暗对比度的样品的表面形貌图像，可得到样品表面的三维形貌图像陈耀文,林月娟,张海丹,等. 扫描电子显微镜与原子力显微镜技术之比较J. 中国体视学与图像分析, 2006, 11(1): 53-58.。AFM的观测模式有三种:接触(contact mode)、非接触式(non contact mode)和轻敲(tapping mode)。
4、在接触模式中，尖端始终与样品表面接触，而非接触模式中，悬于空气中的尖端仅于样品表面吸附水层接触而不与样品接触。轻敲模式中，尖端与样品间歇接触，通常每秒接触300000次，减少接触模式中产生的剪切力对于样品的破坏，这种模式通常适宜那些质地偏软的食品和生物样品芦鑫，程永强，李里特. 研究蛋白质凝聚凝胶的技术进展J. 中国粮油学报, 2010, 25(1): 132-137.。1.2 AFM的特点及应用与传统的电子和普通光学显微镜相比，AFM具有以下优点Yang H S, Lai S J , L i Y F, et al. App lication of Atomic Force Microscop
5、y as a nano-technology Tool in Food Science J . Journal of food science, 2007, 72 ( 4) : 65 -75.Shewry P R, Miles M J, Humphris A D L, et al. Scanning Probe Microscopy Studies of Cereal Seed Storage Protein Structures J . Scanning, 1999, 21: 293 - 298。高分辨率。AFM没有透镜，因此不受衍射极限或者球面像差的限制，对于某些样品可以实现原子级别的分辨
6、率。简化样品的处理过程。AFM是非破坏的分析方法，AFM的样品制备非常简单，一般直接将样品放在AFM的载体上，载体可选择云母片、玻璃片、石墨、金、二氧化硅和某些生物膜等，最常用的是新鲜解离的云母片。按照不同的实验要求，AFM可在真空、气体空气或液体多种环境下进行观测，在自然状态下对样品直接进行成像，产生清晰的、可重复的高分辨图像。特别是对生物样品的观察，AFM能在近生理条件下(空气中或液体中)或生理条件下直接成像，以分子或亚分子分辨率得到生物分子及样品表面的三维图象，解决了用扫描电镜观察细胞时样品的变形和损伤问题，同时， AFM对样品基本没有破坏。但是， AFM在液体中成像时，样品的固定较困难
7、，特别是对生物大分子。可同时得到样品的二维和三维成像。AFM技术可真实地得到样品表面的形貌结构图像，图像是真正的三维图像，并能测量样品的三维信息，如样品的硬度、弹性、摩擦力、粗糙度，磁场力，导电性，温度分布和材料表面组成等样品特性，提供不同样品的成分信息。采用轻敲模式AFM观察到加热后-乳球蛋白，发现它形成一种有规律的纤维结构，长度约25nm，厚度是1或2个蛋白单体54。这证明在低pH低离子强度下，形成的热导致-乳球蛋白纤维体需要进行两步以上的反应Ikeda S, Morris V J. Fine - stranded and particulated aggregates of heat -
8、 denatured whey proteins visualized by atomic force microscopy J . Biomacromolecules, 2002, 3:382 389.。Iwasaki等54采用AFM分析加热对于肌浆球蛋白丝形态的影响，发现在70 时原来的串珠结构变成绳子结构，但是少量蛋白丝的结构没有明显变化。Yang等Yang H, Wang Y, Regenstein J M, et al. Nanostructural characterization of catfish skin gelatin using atomic force microsc
9、opy J . Journal of Food Science, 2007, 72 ( 8) : C430 - C440.使用AFM观察鲶鱼凝胶结构，发现鲶鱼凝胶中具有平均直径为118 nm的环形孔洞，球形凝聚体的平均直径为267 nm。他们认为球状凝聚体和环形孔洞的形成与水和离子渗透过正在水解胶原质时的方式有关。AFM能从分子水平上解释食品流变学特性的差异，从力学的角度揭示蛋白凝聚特性。Iwasaki等Iwasaki T, WashioM, Yamamoto K, et al. Rheological and morphological comparison of thermal and hydrostatic p ressure - induced filamentous myosin gels J . Journal of Food Science, 2005, 70 (7) : 432 - 436.报道了采用AFM分析由热导致和压力导致的细丝状肌浆球蛋白凝胶中的串珠结构和弹性之间的关系。近期出现的阶段成像，力调制模式等新技术，使AFM能够定量测定物质弹性。然而，目前AFM也有以下缺点：AFM的工作区域选择非常盲目，相对较小的扫描面积，只能在微米尺度范围进行扫描，较慢的扫描速度，对于较大样品表面和过于软的样品成像困难等。
