毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

《毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒（31页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译 后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组 织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具 有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百 倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化 基因置换 基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也

2、可用于毕赤酵母。 例如：His4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野 生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如His4、Leu2、Arg4、TR11、Ura3等基因 在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧 化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要 在一个特殊的细胞器一过氧化物酶体一里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于 醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧 化物酶的启动子

3、也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性 蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋 白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX

4、1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在 含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时， 推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因 达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1突变表型：缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株 (methanol utilization slow)，过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。 结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+ ( methanolutilizat

5、ion plus)指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在 毕赤酵母转化子中的整合方式。蛋白胞内及分泌表达：外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将 外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗商汉桥泌信号序列，利用酿酒酵母a因子前原肽信号序列也获得许多成功。分泌表达外源蛋白的最大优点是：毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最 小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的

6、外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成 份，也可算作蛋白纯化的第一步。注意，如果外源蛋白一级结构中有可识别的糖基化位点 （Asn-X-Ser/Thr），则这些位点可能发生糖基化。翻译后修饰：与酿酒酵母相比，毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有优势，因为不会使其过糖基化。 酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型，然而毕赤酵母中蛋白转录后所增 加的寡糖链长度（平均每个支链8-14个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150个甘露 糖残基）短得多。另外，酿酒酵母核心寡糖有末端a-1,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为酿酒 酵母中糖基化蛋白的a-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白

7、不适于治疗应 用。虽然未经证明，但这对毕赤酵母产生的糖蛋白不构成问题，因为毕赤酵母表达蛋白与高 级真核生物糖蛋白结构相似。选择载体用于基因多拷贝整合：在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该试剂盒中 的三个载体均可用于在体内（pPIC3.5K, pPIC9K）或体外（pAO815）产生并分离多 拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传 霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1 启动子来诱导高水平表达

8、。多拷贝插入频率：毕赤酵母His+转化子高拷贝整合事件自发发生的概率为1-10%，体内方法可筛选可能 插入多拷贝外源基因的His+转化子，体外方法可通过连接构建多拷贝子。当选择His+转 化子时，它们中插入体外构建结构多聚体的概率很高。体内多拷贝插入的产生：Ppic3.5k及Ppic9k含有细菌kan基因，赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，注意Kan并 不赋予毕赤酵母卡那霉素抗性。遗传霉素抗性水平主要依赖整合的kan基因的数目。单拷 贝Ppic3.5k或Ppic9k整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约0.25mg/ml的遗传霉 素抗性水平。任何载体多拷贝整合可增加遗传霉素抗性水平，从0.5mg/ml

9、 （1-2拷贝） 到4mg/ml （7-12拷贝）。由于kan基因与表达盒（pAOX1及目的基因）之间有遗传连 锁，可从遗传霉素高抗性推断该克隆所包含多拷贝目的基因数。由于基因的剂量效益，蛋白 的表达可能会增加。因此，kan基因可检测转化子是否含有多拷贝目的基因。下图显示多 拷贝插入及kan基因与表达盒的连锁。PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 制作者：陈苗商汉桥 遗传霉素直接选择：在酵母中对遗传霉素抗性进行直接选择并不十分有效，因为新转化的细胞需要时间表达 足够量的抗性因子。由于酵母生长比细菌慢得多，大部分重组酵

10、母在积累足够多的抗性因子 以抵抗平板上抗生素之前就已经被杀死了。最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序 需要先对HIS+转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。虽然可以用电泳进行直接筛选，但用在遗传霉素筛选之后再进行电泳筛选，获得含高拷 贝克隆的机会更大，大约可获得5-9拷贝的克隆，而直接电泳选择只能获得平均为1-3拷 贝的克隆。原生质转化时不能用遗传霉素直接选择。体外多拷贝插入的产生：下图显示如何产生多表达盒插入载体以转化毕赤酵母。目的基因插入独个EcoRI位点后，产生的表达盒（pAOXl及目的基因）上下游侧翼分别为独个的BglII及BamHI位点。 含目的基因的pAOX815用

11、BglII及BamHI消化以分离表达盒，表达盒再插入BamHI 位点以产生串联重复表达盒，重复该插入程序可产生一系列含单个HIS4基因及逐渐增加 数目表达盒的载体。用体外形成的多拷贝子转化毕赤酵母增加了多拷贝表达盒重组子出现的频率，可设计包 含一特定数目多拷贝插入的毕赤酵母重组子。转化及整合：可产生两个不同表型的His+重组菌株：质粒DNA线性化位置不同，转化GS115后可产生两种转化子His+Mut+及His+Mutso KM71只产生His+Muts，因为该菌株为Muts 表型。两种重组子Mut+及Muts都是有用的，因为一个表型可能比另一个表型更有利于 蛋白表达。理想条件下，每一个表型应

12、该检测6-10个重组子。没有办法预测哪个结构或 克隆更利于蛋白表达。强烈推荐用PCR分析重组子来证实整合情况。成功将基因构建至AOX1启动子下游后，线性化质粒转化毕赤酵母时激发重组。下图 显示用不同酶消化时产生何种重组子。限制酶 插入事件GS115表型KM71表型SalI 或 StuI 插入 his4 His+Mut+、His+MutsSacI 插入 5AOX1 His+Mut+ 、His+MutsBglII 取代 AOX1 His+Muts His+Muts （不推荐）PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗

13、商汉桥表达及扩大培养：用PCR证实毕赤酵母重组后，可检测His+Mut+及His+Muts的表达。小规模培养每个 重组子，用甲醇诱导，检测时间点.如果是胞内表达，每个时间点细胞沉淀用SDS-PAGE分 析;如果是分泌表达，分析每个时间点的细胞及上清。如果有蛋白的抗体，推荐既用考马斯 亮蓝染色又用western blot分析SDS-PAGE凝胶。如果可以，建议检测蛋白活性。因为并 不是所有蛋白都能达到g/l的水平，所以建议进行western blot或活性分析，不要仅做 SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析。如何选择最佳的表达蛋白毕赤酵母菌株及优化诱导见P49-50O如表达已达最优，大规 模表达以

14、产生更多蛋白。PDF created with pdfFactory trial version 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒制作者：陈苗商汉桥方法毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115及KM71在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变，因而不能合成组氨酸， 所有表达质粒都有HIS4基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。 GS115及KM71自发回复突变到His+原养生物机率小于1/108。KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中 不能生长。用野生型ARG4基因破坏AOX1基因后，产生KM71 MutsArg + His-菌株。 GS115

15、及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。 转化之前，GS115及KM71都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。KM71结构：ARG4基因（约2kb）插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI（AOX1基因15/16密 码子）及SalI（AOX1基因227/228密码子）位点ARG4取代了 AOX1基因16 227密 码子。此结构转化至KM71亲本菌（arg4his4）中，分离Arg+转化子并分析Muts表型。 Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1:ARG4结构所取代。重点：用KM71的优点是，不需要在甲醇最小培养基中筛选Mut表型。所有转化子都是Muts 表型。第二，AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替 换aox1:ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长 时需精氨酸。不幸的是，仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4突变的影响，arg4菌株在含 精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。因此不推荐在KM71中通过取代aox1:ARG4 结构来获得His+转化子。菌株表达对照：GS115/His+Muts白蛋白：该菌株为筛选毕赤酵母分泌表达转化子与Muts表型时的对 照。血清白蛋白基因及其自身分泌信号被整合进毕赤酵母AOX1位点。该菌株可分泌白蛋 白（67kDa）