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1、不同类型铅中毒大鼠模型的神经系统毒性（学习记忆障碍）机制比较研究摘要大量的流行病学调查和研究表明，铅中毒可诱发肾脏、神经系统、造血系统损伤，特别是对脑发育的影响备受关注，大家公认为发育大脑更容易受到铅的损害，国内外有许多关于铅中毒对脑发育影响机制研究，但其物质基础如何，仍未完全明确。铅中毒对成熟大脑影响的报道相对较少，有关铅中毒对发育大脑和成熟大脑影响的机制差异并没有系统报道。本次实验采用幼年和成年的大鼠以腹腔注射和自由饮用醋酸铅溶液的方式给药，分别选用幼年和成年大鼠分别建立了急性和慢性铅中毒模型，造模成功后，进行水迷宫实验，了解大鼠的记忆和识别能力，处死大鼠后，采用病理和免疫组化方法，研究不
2、同类型铅中毒大鼠中枢神经系统的神经元、星状胶质细胞的生长情况，了解神经元环路的变化情况。采用原子吸收测定、生化试剂测定、酶联免疫法方法和分子生物学技术研究中枢神经系统的氧化和抗氧化防御系统，了解活性氧的产生情况和氧化应急的损伤情况，同时分析脑组织中钙离子代谢、多种激酶的活性及主要神经递质和信号分子的变化情况，了解铅中毒对大脑内的代谢和信息传递的影响。通过一系列实验对不同类型铅中毒大鼠的行为学，解剖组织学、代谢学和信息学等多方面比较，寻找两种大鼠铅中毒模型的差异，进行有关指标的进一步研究，寻找可能的新机制，为铅对中枢神经系统的毒性机制进一步研究提供理论支持，同时为排铅药物筛选研究提供实验基础。铅
3、中毒，大鼠，大脑，中枢神经系统。不同类型铅中毒大鼠模型的神经系统毒性（学习记忆障碍）机制比较研究一、项目可行性报告（一）立项的背景和意义铅对环境的污染日益加剧,已由职业环境扩展到日常环境.实际上，随着我国的社会经济发展，特别是汽车保有量和房屋装修业的迅速增加，每个城市都面临环境中的铅负荷不断上升的危险，而铅可通过皮肤、呼吸道、消化道进入人体，诱发肾脏、神经系统、造血系统损伤1。1999年8月全国部分地区和城市儿童血铅水平调查，平均38.8%的儿童血铅水平超过100 gdL-1。也就是说，我国城市儿童中有约40%左右受到铅中毒的威胁2。近年人们生活条件提高了，但铅中毒事件任然严重，国内外常常报道
4、铅超标或中毒的事件3,4,美国、加拿大等均报道交通警察血铅超标严重4。浙江省近年不同地方报道中毒的事件， 2005年浙江中部的东阳、兰溪、永康、义乌、浦江、绍兴等市县的锡箔产业的大量从业人员和上千名儿童发生铅中毒事件，2011年在浙江台州和德清的电池生产厂引起周围数百位居民铅中毒事件。由此可见，铅中毒已经是比较严重的社会问题，探索铅中毒的毒性机理，研究防治措施和筛选相关药物有非常重要的现实意义。在铅中毒对人体的危害方面，研究发现5-6，铅能引起贫血，脑发育、肝、肾功能损害，降低免疫功能，致癌等作用。其中对脑的影响最为严重，由于脑是铅最敏感的器官，微量铅即可引起神经系统的功能障碍,严重中毒可引起
5、中枢神经细胞退行性改变，导致脑病，儿童可导致智力低下，认知缺陷5，因此，铅中毒的很多深入研究是关于脑部的毒性损害。铅对脑的损害集中在一些特殊的区城。最首要的部位包括大脑皮质的额前区，海马回和小脑。这些区域的神经元如颗粒细胞和小球周细胞等主要参与学习记忆，而在这些区域的胆碱能系统中重要的神经环路，如隔-海马、斜角带-嗅球、Meynert基底核（NBM）-新皮层等具有维持正常的学习记忆功能7-8。星状胶质细胞参与维持正常的学习记忆功能9。铅中毒的一些特征性的临床表现有可能正是与这种特殊的解剖部位的特点密切相关。如大脑皮质额前区的损伤可以引起认知功能的损害，并可引起进行性的注意力分散10。大量研究显
6、示11，铅引起氧化应急损伤，一方面铅作为氧自由基的启动剂而诱发氧自由基的产生，铅通过线粒体产生活性氧,同时还可抑制氧自由基的清除酶(SOD，CAT)活力，使血，肝和脑中MDA含量增高。另一方面铅作为琉基的亲合物质易于与含疏基的酶(GSHPx，G6PD，GR)或物质(GSH)结合而使相应酶活力下降和琉基耗竭，因此使机体的抗氧化能力下降，进一步增强脂质过氧化的毒理效应。Yiin和Lin等人的研究证明12，铅能显著增加油酸，亚油酸和花生四烯酸中MDA的含量，且脂肪酸中双键数目越高，其相应体系中MDA含量也越高。铅能诱导花生四烯酸的聚集，从而增加细胞膜脂质过氧化的敏感性13。铅在体外能与磷脂双分子膜紧
7、密结合14。体内实验也证明15，脂质过氧化水平的增加和磷脂水平的下降与脑区的铅浓度显著相关。因此，转变的膜脂质成分可导致细胞膜完整性，渗透能力的变化,使细胞质膜结构受损，细胞内的线粒体和内质网释放凋亡相关物质，促进细胞凋亡。铅可取代钙的作用，影响细胞内多种激酶的活性等多个环节，铅可以通过与钙离子竞争进入细胞内，干预突触前终端钙离子而对LTP起作用16。还可作用于突触后膜上电压依赖性的钙离子通道，阻断钙离子电流6,铅可以激活蛋白激酶C(PKC)系统，引起细胞内游离钙浓度的升高，而胞内钙离子超载是神经细胞损伤死亡的重要原因。铅还作用于钙调素-蛋白激酶和cAMP-蛋白激酶等使钙调蛋白依赖性蛋白激酶(
8、CaMK)失活5,17，减少ERK2活性维持时间，降低ERK2通过调节细胞骨架蛋白、核蛋白和信号蛋白等发挥其对突触可塑性的调节和学习记忆的形成。铅还可以通过抑制腺苷酸环化酶间接抑制蛋白酶磷酸化过程，从而影响学习记忆过程18。铅可以破坏星形胶质细跑19。另外的几项研究表明 20,21,铅模拟钙样作用，激活NMDA受体复合物、活化NOS，引发自由基气体分子（NO）合成增加及自由基连锁反应，导致组织细胞的变性与坏死;同时，NMDA受体复合物的激活与N0对sGC的活化引起胞内cAMP水平升高，进而刺激突触前膜兴奋性氨基酸释放异常，导致神经兴奋与传导异常，表现出神经行为异常。总之，有关铅对脑损伤机制方面
9、，国内外学者目前已经达成广泛的共识5-6：铅通过诱发细胞内过氧化物含量升高，破坏细胞的结构；通过影响钙离子代谢、细胞内多种激酶的活性等多个环节，影响脑内少突胶质细胞和星状细胞的正常功能，并诱导神经元凋亡的过度表达。这个机制解释了许多铅致脑损伤的毒理原理，但仍有一些机理任未明确，如神经环路受损便出现严重的学习记忆障碍的问题，虽然国内外学者普遍认为铅中毒可引起严重的认知障碍，但这种神经行为障碍是否与基底前脑胆碱能系统异常有关仍未明确。针对目前很多铅中毒研究主要集中在发育脑，对成熟脑研究比较少，且一些铅中毒的作用机制不明的情况下，本研究采用系统研究法：通过选用幼年和成年大鼠分别建立急性和慢性铅中毒模
10、型22，测定铅中毒大鼠学习记忆能力，同时观察铅对大鼠脑神经发生、基底前脑成熟胆碱能神经元及星形胶质细胞的毒性效应，另外分析引起铅中毒的主要机制涉及的指标在不同模型动物的表现，发现铅对不同生长时期的脑损伤差异，寻找差异产生的可能原因，进行有关指标的进一步研究，寻找可能的新机制，为铅神经毒性机制的进一步研究积累实验基础。参考文献1Ji A, Wang F, Luo W, Tang R, Chen J, Cai T. Lead poisoning in China: a nightmare fromindustrialisation. Lancet 2011; 377: 147476.2Shen X
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