蛋白质组学常见问题

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1、HPLC 篇1 . HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法样品量不足：解决办法为增加样品量样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器检测器衰减太多：调整衰减即可。检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。检测池中有气泡：解决办法为排气。记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。流动相流量不合适：调整流速即可。检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。2 .做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？原因可能有：？泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进

2、行脱气处理；比例阀失效，更换比例阀即可。泵密封垫损坏，更换密封垫即可。溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；系统检漏，找出漏点，密封即可。梯度洗脱，这时压力波动是正常的。3 .我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？ 柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的 问题，您可按下面步骤检查问题的起因。拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检 查。将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检

3、测器，以防固体颗粒进入流动性）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛 板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间 接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解 决这一问题的最佳选择。4 .液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。存在干扰峰，解决办法为使用较长柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。双向电泳篇1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D的一向吗？一般

4、情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这 样跑完1D和2D胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条 转移到另外一个电泳漕中进行电泳。2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？这是因为BioRad的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应 的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而 降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影 响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 %满）的矿物

5、油。3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压（50 U A/胶）？电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条 的温度增加。当温度超过30摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子， 从而对等电聚焦产生影响。4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高?刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段， 电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的 电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移 动到对应的pH条带），体系内的蛋白质才开

6、始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH区域移动。5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的漠酚蓝被聚焦所产生的。漠酚蓝也是pH指示剂，当它移动到 酸性区时（pH4 ），颜色会变成黄色。漠酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的 聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH值区域值，从而变成 中性分子。这样，体系的电阻越来

7、越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pl值区域，而成为中心分子。这是加在 体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。9.重泡胀缓冲液（rehydration buffer）中的硫月尿的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增 加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的pH值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋 白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而 硫尿和双极性小分子则

8、会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。10. 怎样估计2D胶上蛋白质点的分子量和pl值？可以用BioRad生产的2D胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。11. 为什么2D胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？横的脱尾可能是：1）一向等电聚焦不完全；2）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）；3） 蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。12, 什么成分会影响2D胶的效果?核酸，盐，去垢剂等等。13. 2D胶的上样量应该在什么范围？上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测 到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在100微克（银染）到5

9、00微克（考染）之间。14. 我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不 会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜 所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。 沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类 的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以TCA法最为普遍使用。使用TCA法时， 一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的TCA和其他沉淀下来的杂质。透析法 只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难

10、。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析 到一个比较干净的环境（不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后 再进行超滤。酶解篇1. 用Trypsin酶解蛋白质时，碳酸氢氨的浓度应该是多少？酶解时碳酸氢氨的浓度一般在1050 mM之间。碳酸氢氨的作用主要是提供一个碱性的 水解环境，因为Typsin的活力在pH89之间最高。最常用的碳酸氢氨浓度有20 mM， 40 mM。盐浓度过大时，后续的冻干过程中会有较多的盐析出；盐浓度过小时，则不能有效的提供碱性pH的水解环境（尤其是在样品的pH值低，而且体积大时）。为了确定酶解 体系的pH值，可以用2. Trypsin储存液的作用是什么？Try

11、psin在pH89活力最高，所以为了防止酶的自水解，Trypsin母液要处于一个酸性的 环境里以便长期保存。Trypsin储存液的pH大约是5.3，是用来稀释母液用的。如果所需 的酶量较大，可以直接用碳酸氢氨溶液来稀释母液。如果酶解的样品少，可以用储存液来 稀释，这样剩余的酶液可以在-800C保存到下次使用。3. Roche的酶和Promega的酶，那个更好？Roche的酶有自降解，而Promega的酶基本上没有自降解。由于酶的自降解峰可以用来做 很好的内标，所以一定限度的酶自降解对MALDI数据的校准很有帮助。4.什么情况下需要用Ziptip来处理样品？当样品含有大量的盐时，需要用Zipti

12、p来除盐；当样品量很少，但体积比较大时（20微升 以上）时，需要用Ziptip来浓缩。如果样品中有甘油，SDS，或其他杂质时，Ziptip的使 用要格外当心，在这种情况下，Ziptip的填料容易被杂质堵塞；另外Ziptip使用不当时， 样品会有损失。所以当样品比较珍贵（的来不易）时，最好先用其他样品做预实验，摸顺 条件后，再作真正的样品。MALDI 篇1. 怎样邮寄我的样品？冻干的胶或干粉可以直接邮寄。切胶后的湿胶（不用做任何处理），放在EP管中（不加任 何缓冲液）；用干冰速冻；邮寄时，置样品于足够的干冰中。液体样品的邮寄方式同湿胶 一样。2. 为什么要使用内标？用内标做校准可以大大减少MAL

13、DI-MS的误差（70ppm ），从而提高查库结果和可靠性。 好的内标肽段需要有以下的要求：最好有两个肽（两点一线）；质量不要在大多数的肽段 范围内（12002500 Da ）；内标的量要与样品的量成比例；内标对其他肽段离子化的 抑止要小。我们实验室使用的内标是25fmol的一一和一一。不过，一般情况下，使用外标做校准也可以达到比较满意的数据（150ppm ）。所以，顾客可以根据自己的需要来 选择是否使用内标。3. 我为什么还要提供正负空白胶正对照提供（exact）对照两块胶？正负对照的两块胶是用来对整个鉴定过程做质量控制的。负对照（空白胶）主要是看样品 是否有污染（比如角蛋白的污染）；正对照

14、（已知胶，比如同一块胶上的标准蛋白）主要 是检测酶解和质谱的效果是否正常。如果客户不能提供正负对照，我们可以使用自己预先 准备的胶条。如果顾客的样品量大（10个2D胶上的点），则顾客必须提供正负对照。4. 对于胶上蛋白质的鉴定，我应该提供多少蛋白质？一般情况下，考染能看得见的点都有机会鉴定出来。分子量在25万之间的蛋白质，鉴 定成功率一般比较大。分子量小的蛋白酶切位点少，合适的肽段（10003000 Da ）就 少，所以鉴定的成功率相对较低。而分子量太大的蛋白质，在同等质量的情况下，蛋白的 摩尔数（pmol）较少；而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低（因为整个蛋白质较大），从 而影响鉴定的成功率

15、。5. 为什么我的MALDI图谱中都是相差44Da的峰，肽段的峰则全被抑制了？相差44Da的峰可能是Triton X峰，也可能是polymer （ -CH2CHOH-）峰。这些polymer是 从EP管的内壁沥滤（leaching ）出来的。所以样品中不能含有Triton X。另外实验中不 能使用加有可塑剂（plasticizer ）或塑料软化剂的离心管（比如PCR管）来装取样品。最 好是使用进口 EP管。另外，可以用60 %的乙腈/0.1%TFA去清洗EP管的内壁以防沥滤。 清洗后，要等到残留液都挥发（air dry or speed vac ）后再装样品。此过程中要注意不让 杂质灰尘落入管

16、内。另外，试验操作过程中所佩戴的塑胶手套也可能有可塑剂。所以一定 要佩戴无尘的手套。每次用手打开或触摸盛有样品的EP管时，一定注意不要碰到EP管盖 的内壁。开盖时，可以使用Eppendorf枪上的金属拉杆（动作如开啤酒瓶盖儿）。从冻干 机中取出EP管时，最好拿在盖子和管子的连接部分或盖子的突出部分。胶的染色和脱色 中，尽量不要触摸胶（即便是带了手套）。可以用厨房用的铲子（带镂空的那种，超市里 有卖）来操作。6 .各种去垢剂对MALDI有何影响？离子型去垢剂对MALDI的影响要比非离子型去垢剂大。去垢剂浓度越高，影响越大。在浓度为1.0% （w/v）时:除了一些糖类的非离子型去垢剂，大部分去垢剂会把蛋白质的信 号减低10倍。At 0.01% d