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1、冻干人凝血因子浓制剂制造及检定规程本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的新鲜血浆分离、提纯、冻干并经病毒灭活制成。主要成份为人凝血因子及少量纤维蛋白原，含适量枸橼酸钠，不含防腐剂。本品对缺秒人凝血因子所致的凝血机能缺陷具有纠正作用，专供防治甲型血友病患者的出血症状。1制造1.1制造要求1.1.1对血浆的要求1.1.1.1所用之血浆来源应符合原料血浆采集（单采血浆术）规程要求，血浆应无凝块、无纤维蛋白析出，非脂血，无溶血。在采集时应减少皮肤损伤，保持血流通畅，并与抗凝剂充分混合，用塑料袋采集。新鲜分离液体血浆或新鲜冰冻血浆及冻结冷沉淀，均可用于生产。1.1.1.2分离后的血浆应保持无菌，并应及时冰冻保
2、存。自采血到冻结一般在8小时内完成。液体血浆应在42贮放，贮放时间应不超过小时，最长不得超过12小时。冰冻血浆（-30以下）保存期不超过6个月。1.1.2对制造工作室、设备及原材料的要求，与人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程中1.1.31.1.4项要求相同。1.2制造工艺1.2.1采用低温乙醇法或冻融法制得冷沉淀，经抽提、吸附、精制，亦可采用经卫生部批准的其他工艺制备，并经卫生部批准的适宜方法进行病毒灭活处理。1.2.2分批同一制造工艺、同一容器混合的制品作为一批，不同滤器和不同机柜冻干的制品分为亚批。1.2.3稳定剂及防腐剂制品内允许加稳定剂，制品应不含防腐剂。1.2.4除菌过滤及分装本
3、品应用微孔薄膜过滤，可直接分装无菌的成品瓶内，每瓶装量根据效价及规格确定。1.2.5半成品检定每批半成品应进行效价测定及热原质试验，并按亚批做无菌试验。1.2.6冻干除菌过滤分装的制品经外观检查后立即冻结，并按人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程1。2。5项规定进行冻干，但制品温度不得超过35。1.3规格每瓶含人凝血因子的效价可有50、100、200、300、400IU五种，制品的效价应标示在瓶签及包装上。2成品检定2.1抽样每批制品应抽样作全面质量检定，不同机柜冻干的制品分别抽样做无菌试验和水分测定。2.2物理检查2.2.1外观应为乳白色疏松体，无融化迹象。溶解后溶液澄清或轻微乳光，允许有
4、微量细小蛋白颗粒。2.2.2真空度以高频火花真空测定器检测，瓶内应出现蓝紫色辉光。2.2.3溶解时间从冰箱取出的制品应先平衡至2537，然后按瓶签标示量加入适量3037灭菌注射用水，使其每ml含4IU。制品应于30分钟内溶解。2.3化学检定按生物制品化学检定规程进行。2.3.1水分水分含量应3%（g/g）。2.3.2pH值取2.2.3项下溶解在202测定，pH值应为6.87.6。2.3.3钠离子测定取2.2.3项下溶液测定，钠离子含量应160mmol/L。2.3.4枸橼酸离子测定取2.2.3项下溶液测定，如加枸橼酸钠作稳定剂，其枸橼酸离子含量应25mmol/L。2.4效价测定取2.2.3项下溶
5、液用一步或二步法（见附录）进行测定，每瓶所含人凝血因子的效价应不低于标示量的80%。2.5比活性每mg蛋白质所含人凝血因子的效价应0.25IU。2.6HBsAg检测用敏感性为1ng/ml以下的试剂盒检测，应为阴性。2.7抗HCV检测用敏感的方法检测，应为阴性。2.8抗HIV-1及2检测用敏感的方法检测，应为阴性。2.9无菌试验样品溶解后按生物制品无菌试验规程进行。2.10安全试验2.10.1豚鼠试验用体重300400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品15IU，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠复试一次，判定标准同前。
6、2.10.2小白鼠试验用体重1820g小白鼠5只，每只腹腔注射检品1.5IU，半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠复试一次，判定标准同前。2.11热原质试验按生物制品热原质试验规程进行，注射剂量按家兔体重注射10IU/kg。判定标准按该4.2项要求进行。2.12鉴别试验用免疫双扩散法，仅与抗人的血清产生沉淀线，与抗马、抗牛血清不产生沉淀线。2.13根据病毒灭活方法，必要时应增加相应的检定项目。3保存与效期应严格保存于10以下避光干燥处，运输期间亦应冷藏。效期自效价检定合格之日起为2年。附录1人凝血因子效价测定（一步
7、法）1试剂1.1样品稀释液：取1容积的3.8%枸橼酸钠液加入5容积咪唑缓冲液。1.1.1咪唑缓冲液称0.68g咪唑和1.17g氯化钠溶于100ml蒸馏水中，加入42.2ml0.1mol/L盐酸，然后被加入蒸馏水至200ml,pH为7.3。1.1.23.8%枸橼酸钠溶液称9.5g枸橼酸钠溶解于250ml蒸馏水中。1.2血小板代用品“兔（人）脑组织的氯仿抽提液”。用前用生理盐水稀释至适当倍数。1.3白陶土生理盐水混悬液称0.5g白陶土加生理盐水至100ml即可使用。1.4基质血浆取人凝血因子含量低于2%的血友病病人血浆或人工基质血浆，然后分装于5ml安瓿，冻干或-30保存。1.50.05mol/L
8、氯化钙溶液称111g氯化钙溶于1000ml蒸馏水中，配制成1mol/L氯化钙贮存液，用前进行20倍稀释，配成0.05mol/L氯化钙溶液。1.6人凝血因子标准品及标准血浆人凝血因子国家标准品或经国家标准品标化的工作标准（定量分装冻干，置-30保存，一般2IU/ml左右），用前取样品稀释液溶解成1IU/ml。标准血浆系取30份新鲜正常人血浆等量混合后，分装于小瓶内，置-30保存。自采血后至分浆冻结整个过程不得超过4小时。1.7待测样品按标示量加入注射用水溶解，测定时稀释成1IU/ml。2测定2.1取2支试管，每管加入0.1ml基质血浆和0.1ml样品稀释液，混匀，再加0.1ml血小板代用品和0.
9、1ml白陶土悬液，混匀，将试管置37水浴保温一定时间（一般26分钟），然后加入0.1ml0.05mol/L氯化钙溶液，记录凝固时间，2管平均值为基质血浆的“空白”值（一般应大于3分钟）。2.2标准品或标准血浆用样品稀释液分别进行10倍、20倍、40倍、100倍和200倍稀释，用不同稀释浓度标准品代替2.1项试验中样品稀释液，按上述方法分别测定凝固时间。2.3待测样品稀释成约0.020.04IU/ml，代替2.1项试验中样品稀释液，同时分别测定凝固时间。2.4测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10%，否则重测。3计算将标准品5个不同稀释度所含人凝血因子单位（IU/ml），分别
10、取其对数值，再将其各相应浓度所测得凝固时间（秒），也分别取对数值，然后按照统计学方法作直线回归方程。方程式：logy=bolgx+a其中x代表人凝血固子单位数，y代表测得相应凝固时间（秒）。将测试样品所得到凝固时间（秒）代入方程式计算x值。然后将所得x值乘以样品稀释的倍数，即为每ml中人凝血因子含量。附录2人凝血因子效价测定（二步法）1材料1.1试剂1.1.10.05mol/LCaCl2溶液称7.35gCaCl22H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。1.1.20.025mol/LCaCl2溶液称3.675gCaCl22H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。1.1.
11、3咪唑缓冲液称0.68g咪唑和1.17gNaCl，溶于约100ml蒸馏水中，加37.2ml0.1mol/lHCl，加蒸馏水至200ml，pH为7.37.4。1.1.4枸橼酸盐-氯化钠溶液1份3.8%枸橼酸三钠溶液加5份0.85%NaCl溶液混匀。1.1.5Al(OH)3胶a称（NH4）2SO45.5g，溶于150ml63蒸馏水中。B称氨明矾19.175g，溶于250ml58的蒸馏水中。C最取12.5ml氨水（比重0.88），加12.5ml蒸馏水。三种溶液配毕后，立即将c液迅速倒入a液中搅匀，然后在搅拌下将此混合液迅速倒入b液，用力搅拌10分钟（保持温度不低于58），离心（2500r/min，1
12、5分钟），弃上清，沉淀洗涤5次。第一次：用75ml蒸馏水加0.055ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。第二次：用75ml蒸馏水加0.11ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。第三、四、五次分别用75ml蒸馏水洗。将沉淀物悬浮于总体积为175ml蒸馏水中，混匀，分装，4保存。1.1.6正常人血清分别收集20份以上正常人血于干燥灭菌的玻璃瓶中，待血凝固后，放于37保温56小时，置4冰箱过液，分离血清，混匀，定量分装（0.5ml/安瓿），冷冻干燥，-20保存。用时，取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解，然后用咪唑缓冲液作110稀释，4冰箱过夜（使血清活化），试验当日再用咪唑缓冲液作最适
13、浓度稀释（一般为120），置冰浴备用。1.1.7牛因子收集公牛血于干燥灭菌的玻璃容器中，室温放置4小时，离心（2500r/min，30分钟），分离血清，取血清加10%（g/ml）BaSO4在室温下搅拌吸附40分钟，离心（2500r/min，40分钟），弃沉淀，定量（1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20保存。用时取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解，用生理盐水作最适浓度稀释（一般为120），置冰浴备用。1.1.8磷脂取新鲜脑（人，牛，兔），除去表面血管、脑膜，尽可能除去白质，切成薄片，称重，轻轻捣碎，用3倍脑组织的丙酮提取5次，每次用双层绸布滤干，最后脑粉于37干燥1小时，称取脑粉1g，加20ml氯
14、仿提取，于室温振摇2小时后，用单层滤纸过滤，滤液放抽气柜内用吹内机吹至微干，加10ml生理盐水研制成白色均匀乳状液，定量（0.1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20保存。用时，取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解后，用盐水作最适浓度稀释（一般为11001500），置冰浴备用。1.1.9基质血浆正常枸橼酸血浆，按3ml分装，-20保存。1.2标准品和样品。2操作2.1试剂混合取稀释人血清、因子、磷脂等量混合，置冰浴30分钟后备用。2.2标准品、样品的准备和稀释2.2.1若试验血浆对标准血装（标准血浆为未吸附者）：二者按1ml血浆加0.1mlAl(OH)3悬浮液混合，置37水浴吸附3分钟，离心取上清备用
15、。2.2.2试验血浆对浓缩标准或试验浓制品对标准血浆：用因子严重缺乏的血浆（因子含量1%）稀释浓缩标准品或试验浓制品使成0.51.0IU/ml，然后按2.2.1法进行吸附处理。2.2.3浓缩试验品对浓缩标准品：直接溶解稀释成0.51.0IU/ml。2.2.4标准品和检品准备好后，立即用枸橼酸盐一氯化钠溶液分别作3个连续倍倍稀释，使最低和最高稀释度的凝结时间在1735秒间（一般为1161256）2.3测定2.3.1第一步，混合物的保温取7支玻璃凝集管放入冰浴中，每管加0.3ml混合试剂，然后于第1、2、3管分别加高、中、低稀释度的标准品各0.1ml，第4、5、6管分别加高、中、低稀释度的样品各0.1ml，第7管加枸橼酸盐-氯化钠溶液0.1ml（作空白）；从第1管开始逐管移入37水浴，加0.05mol/L预温CaCl2溶液0.1ml，混匀，记时。
