《褐环粘盖牛肝菌的研究性论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《褐环粘盖牛肝菌的研究性论文（20页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1引言褐环粘盖牛肝菌(Suillus luteus )是一种应用价值很大的外生菌根真菌，它具 有拮抗性强、适生范围广、菌根效益显著等特点1。自然界大部分植物都有菌 根，有些植物没有菌根就不能生长或生长不好2。菌根能代替根毛扩大寄主植 物根系的吸收面积，有效促进植物对土壤营养的吸收3-7；产生的植物激素、 抗生素、酶和挥发性物质，对植物生长发育及分化起着调控等多重作用8；对 根部土传病害有屏障作用，增强寄主植物的抗病性9-13；能极大提高植物对寒 冷、高温、干旱、过湿、高盐以及含有过量有毒物质等不良环境的适应能力 14-17，提高新建苗圃、引进树种的育苗成活率18-20。随着人们对外生菌根 与植
2、物生长关系的认识不断深入，外生菌根在生态稳定、农林生产等方面所表现 出来的重要性已越来越引起人们的关注，并积极开展对外生菌根菌应用的研究。 主要的应用方式是将外生菌根菌的子实体、菌丝、胞子等制成菌剂，用于菌根化 苗木和大面积造林。其中菌丝是真菌无性繁殖的营养体，具有遗传性能稳定、不 需要经过胞子萌发阶段、能迅速与树木形成菌根等特点21，因此对外生菌根真 菌菌丝体菌剂的应用研究最为广泛。国外对外生菌根菌菌丝体菌剂开发应用较 早，80年代初，美国的Danieson和Boyle用菌丝悬液接种班克松和黑云杉苗木根 系，菌根形成较好22。目前，美国已研制成功十几种商业剂型，比较大的菌剂 生产商是PHC公
3、司和FMA公司。法国是将菌丝体包埋于海藻胶丸内，形成胶丸菌剂。 澳大利亚也完成了胶丸菌剂生产的工业化技术研究23-24。国内对外生菌根真 菌菌丝体菌剂的研究起步较晚，目前正处于发展阶段。闫伟等将彩色豆马勃菌丝 体粉碎后，与一定浓度的海藻酸盐溶液混匀，并注入固化剂中固化成型，研制成 功了高效胶囊菌剂25。中国林业科学研究院林木菌根研究开发中心自20世纪80 年代以来通过筛选出适合不同立地条件和树种的优良菌根真菌，已研制成功多种 剂型菌根剂，并建立了我国首条菌根制剂生产线，年产可达1000t26。外生菌 根真菌菌丝体菌剂的生产方式主要有两种，一种是固体培养，另一种是液体培养。 固体培养是指利用自然
4、底物如木质、草质进行固体发酵，其主要特点是发酵体系 没有游离水存在，菌丝的生长是在有足够湿度的固态底物上进行。底物则既不溶 于水，也不悬浮于水中，它不仅起到一个提供碳源、氮源、水分、无机物和其它 营养物的作用，同时也为微生物的生长提供了一个固定的位置。用营养液浸湿的 蛭石和草炭是产生外生菌根真菌菌丝的极好基质27。中科院沈阳应用生态研究 所和北京林业大学等，先后用棉子壳、麦麸子、木屑、玉米粉等为基质扩大培养 菌根菌，取得了良好效果28。液体培养是采用液体基质，通入无菌空气或加以 振荡和搅拌来进行菌丝体的培养。液体培养与固体培养相比有很多优越性：1) 生产周期短，菌种在液体培养下的生长周期一般为
5、10-15天，而固体培养一般需 要30天左右29，仅发菌时间就比固体培养节省了2/3-1/2; 2 )产量高，在液体 深层培养中，菌丝细胞能在反应器内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比等条 件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝 生长分裂迅速，能在短时间内产生大量的菌丝体30; 3)菌龄一致，由于固体 培养是菌丝在固体基质中蔓延长成的，这样处于基质顶部和底部的菌丝体菌龄差 异较大，往往底部菌丝刚开始生长，顶部菌丝就已接近老。而液体培养就不一 样，菌种生长发育均匀一致，菌龄整齐；4)产物易加工，固体培养的菌丝与固 体基质紧密结合，不易分离。液体培养的菌丝取样容易，
6、可以精加工成各种类型 菌剂。因此利用液体培养的方法生产外生菌根真菌菌丝体前景更为广阔。鲁达科 夫利用洁净的甘蓝或马铃薯100g，用1000mL清水煮沸后过滤其残渣留下汁液并加 入0.3%的葡萄糖和微量的维生素B1,混匀后经高温灭菌消毒接入菌根菌种进行培 养，待菌丝体长好后用消毒研钵碾碎菌丝体并配制成悬浮液接入通气的液体培养 液中进行再次扩大培养，可以获得大量的菌丝体31。Marx利用MMN培养液接种 菌种，在摇床和发酵罐中进行液体培养，在高强度通气条件下，菌丝体可大量 繁殖32。童竞心等采用液态通气的方法扩培彩色豆马(Pisolithustinctorius) 菌丝体，用于接种国外松，取得了较
7、好的效果33。王学聘等对厚环粘盖牛肝菌 (Suillus grevillei)进行深层发酵培养，认为该菌具有发酵周期短，生长迅 速，易于工业化生产等特点34。但到目前为止，只有少数几个菌种可以通过液 体培养的方法生产出菌丝体菌剂，其主要原因是大多数外生菌根真菌在液体培养 的条件下生长缓慢甚至不能生长，无法繁殖出足够的菌丝体在生产实践中使用 35。外生菌根真菌菌丝体的生长不仅取决于菌种本身的性能，关键还要赋予它 合适的生长条件。因此，在纯培养的条件下对外生菌根真菌的生长特性进行研究 显得尤为重要。根据以往的研究，褐环粘盖牛肝菌在液体培养的条件生长比较缓 慢，所以无法制成菌剂，限制了它的进一步应用
8、推广。本论文以固体纯培养和液 体纯培养的方法，对褐环粘盖牛肝菌的培养条件进行了研究，旨在为以后的工 业化生产其菌剂提供理论依据。1.1真菌培养条件的研究影响真菌生长的因素主要包括培养基、pH、种龄等方面， 各个影响因素也不是单一作用，它们之间的关系比较复杂，而且在实际运用当中 这些因素还是处于不稳定的状态36。1.1.1培养基培养基是按一定比例配制的多种营养物质混合物，其主要作用可概括为形成结 构(参与细胞组成)，提供能量(机体进行各种生理活动所需要的能量)，和调 节作用(构成酶的活性成分和物质运输系统)。培养基的组成对菌体的生长繁殖、 生物合成都有重要的影响，因此优化培养基是优化真菌培养的首
9、要前提。郭思琪 等通过对厚环粘盖牛肝菌的菌种培养基筛选研究表明，适宜厚环乳牛肝菌生长的 培养基组成为：麦芽糖2g，葡萄糖2g，可溶性淀粉2g，硫酸镁0.15g，硝酸钙0.15g， 磷酸二氢钾0.125g，水1000mL37。姚庆智等人通过对11株外生菌根真菌菌株纯 培养营养生理特性的研究表明，11株外生菌根真菌适宜的基础液体培养基为麦芽 汁培养基和Pachlewski培养基38。王平章以麦芽为原料制成麦芽汁培养基来培 养毕赤酵母(Pichia pastoris)基因工程菌，其经济效益及产出与投入之比是 合成培养基的200倍39。Zhu等用黑箱模型，设计优化轮枝链霉菌(Streptove rti
10、cillium)的产酶培养基，使酶活提高了4倍40。培养基的组成成份主要有 碳源、氮源、无机盐及微量元素和生长因子等。1.1.1.1 碳源碳源的主要作用是供给真菌生命活动所需要的能量和构成菌体细胞成分和代谢 产物中的碳素来源。由于各种真菌的生理特性不同，不同的真菌利用碳源的品种 也不完全相同。常用的碳源有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、玉米粉、以 及动植物油脂、矿油、碳氢化合物等。大多数外生菌根真菌可以利用单糖，有一 些可以利用双糖和多糖。Palmer等人研究了粘盖牛肝菌(Suillus bovinus)对 不同碳源的利用情况，发现较理想的碳源依次为葡萄糖、甘露糖、木梨糖和麦芽 糖，而对甘油
11、和蔗糖利用效果不理想41。Tomoyuki等通过对十几种牛肝菌的营 养特性的研究得出结论，葡萄糖是这些外生菌根菌普遍利用良好的碳源，并且高 浓度的碳源会促进真菌的生长42。Takefum等研究了外生菌根真菌将不同脂肪 酸和油酸作为碳源的能力，发现不同菌种对脂肪酸和油酸的利用能力不同43。 腐生真菌可以通过分泌纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶等胞外酶分解利用纤维素 和木质素，外生菌根真菌由于分泌纤维素酶的能力较差而普遍不能利用。纤维素 酶是一种诱导酶，肖光辉对香菇(Lentinus edodes)的研究发现，培养基加入 少量的易利用的碳源如米糠，可逐步诱导纤维素酶的产生44。当培养基中加入 少量葡萄
12、糖为起始碳源，黄口蘑可适度利用纤维素。Lamb等研究发现，在葡萄糖 的存在条件下，一些粘盖牛肝菌可以很好的利用糊精和可溶性淀粉45。碳源浓 度对真菌生长的影响极为明显，在一定的浓度范围之内，菌体生长量随碳源浓度 增加而增加，但是碳源浓度过高，渗透压增大会影响菌体生长。花晓梅对彩色豆 马勃的最佳营养源进行了研究，结果表明，彩色豆马勃的最佳碳源为玉米粉，当 浓度为4%时，菌丝干物重最大，当浓度超过4%，干物重逐渐下降46。另外，碳 源浓度过高，会促进真菌分泌酸性物质，使培养基的下降47。1.1.1.2 氮源氮源是用来合成真菌细胞中的含氮物质的。常用氮源主要分为有机氮源和无机 氮源。有机氮源除含有丰
13、富的蛋白质和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、 脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子。常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水。 真菌在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌丝体生长迅速的特点。如大 多数食用菌在有机氮源培养基上生长健壮、速度快，在无机氮源培养基上生长缓 慢、细弱48。外生菌根真菌对酰胺类的有机氮源利甬较好 如谷氨酰胺和门冬 酰胺52 o对无机氮源中的铵盐利用较好，某些外生菌根真菌非但不能利用硝酸 盐，反而会受到毒害。郭秀珍等从油松上分离的一种牛肝菌和厚环粘盖牛肝菌， 对有机氮利用最好，其次是铵态氮，而对硝态氮的利用最差31。但有些外生菌 根真菌对硝酸盐的利用效果与铵盐一样，如外生
14、菌根真菌白毒伞(Amanita Verna)，磷酸氢二铵和硝酸钾是其生长的最好氮源49。Tibbett分析了外生菌 根真菌Hebeloma spp在无机氮源和有机氮源的生长时发现大部分株系在有机氮 源即谷氨酸生长要优于无机氮50。Abuzinadah等以有机氮源作为外生菌根真 菌的氮源研究发现，不同的外生菌根真菌对不同形式的有机氮源的吸收利用存在 很大差异，有的真菌能在蛋白质和多肽上生长，有的则生长较弱51。真菌对无 机氮源的利用迅速，菌丝生长启动较快，以后的生长比较平缓；在有机氮源上生 长的真菌菌丝启动较慢，但能保持较长的高生长率时期。因此，在真菌培养的研 究当中，很多都利用无机氮源和有机氮
15、源按一定比例配制的复合氮源作为真菌生 长的氮源。如花晓梅等的研究结果表明，以蛋白胨和氯化铵组成的复合氮源培养 彩色豆马勃菌丝体，菌丝体的生长势要优于单一氮源46。一般来说，氮源浓度 与真菌的生长有很大关系，氮源浓度高，菌丝体生长旺盛，但会使培养基pH偏高， 氮源浓度过低，则菌丝体繁殖量少。Dickie等在不同浓度的蛋白质培养基上对彩 色豆马勃等7种真菌实验证实，供试的7种真菌中有5种在高浓度氮上生长很好， 有1种在低浓度上生长很好，有1种没有差别52。此外，Colpaert研究认为，真 菌氮的代谢可能与pH值有关，因为在不同的pH值时真菌Amanita muscaria表现出 不同的蛋白酶形态
16、53。1.1.1.3无机盐及微量元素无机盐为真菌生长、发育代谢所不可缺少的重要营养元素。它们参与真菌细胞的 合成、辅酶代谢、能量转移，作为酶的激活剂控制原生质的物理性质和细胞的渗 透性，在菌体与培养基之间起重要的缓冲和调节作用。一般真菌所需要的无机盐 包括硫酸盐、磷酸盐、氯化物和含钾、钠、镁化合物等。外生菌根真菌对磷酸盐 的需要量较大，但培养基中磷酸盐浓度过高同样会对菌根真菌的生长产生抑制54。袁玲等通过研究钾离子对外生菌根真菌菌丝生长的作用时发现，液体培养 基中的钾离子会影响真菌分泌酸性物质和对其他养分的吸收利用55。Nagarajan指出，适量的钠盐对菌根真菌细胞质代谢有促进作用56。Blomberg 则发现，在0.05mol/L-0.2mol/L之间，钠盐抑制了菌根真菌菌丝酶的活动57。 微量元素包括铜、锰、锌、铁、钻、铝、碘、澳等，它们多数是辅酶的成
