《猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建论文33514》由会员分享，可在线阅读，更多相关《猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建论文33514（29页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建目 录摘 要III关键词IIIAbstractIIIKey wordsIII英文缩略词表IV1前言11.1口蹄疫的基本特征11.1.1口蹄疫病毒基本概念11.1.2口蹄疫病毒生物学特征11.1.3口蹄疫病毒危害11.2泛素蛋白及其对抗原的影响21.3 siRNA干扰机制31.4 干扰素与口蹄疫免疫41.5 FMD疫苗研究进展51.6本实验研究的目的与意义62实验材料62.1菌种、毒株、载体与质粒62.2主要药品与试剂62.3主要培养基及配制72.4缓冲液及其配制72.5其他溶液72.5空斑筛选与纯化相关试剂82.6寡核苷酸引物83实验方法83.1转移载体P
2、IECMVUbiP1P1SiFIFN的构建策略83.1.1限制性内切酶酶切反应93.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测93.1.3酶切产物的回收93.1.4回收产物的去磷酸化反应93.1.5目的基因与载体的酶连反应93.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化103.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）103.2.2质粒的转化103.2.3质粒的小量制备（OMEGA试剂盒）103.2.4质粒的大量制备（OMEGA试剂盒）113.2.5阳性质粒的酶切鉴定113.3以PRV为载体表达FMDV抗原蛋白基因P1，泛素蛋白与抗原P1的融合基因Ubi- P1，RNA干扰基因shRNA，干扰素
3、基因IFN-的重组病毒的构建123.3.1细胞的培养、冻存与复苏123.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组DNA的提取123.3.3脂质体介导的共转染133.3.4重组病毒空斑纯化和PCR鉴定133.3.5鉴定用PCR模板处理143.3.6重组病毒PCR鉴定144结果与分析154.1转移质粒PIECMVUbiP1的构建154.2转移质粒PIECMVUbiP1P1的构建154.3转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFN的构建164.4共转染产物接毒第三代PCR鉴定174.5重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定184.5.1空斑的形成184.5.2在PK-15细胞上的第一轮空斑筛选1
4、94.5.3在Vero细胞上的第一轮空斑筛选204.5.4 重组病毒的空斑筛选结果205讨论205.1 载体的构建205.2 细胞的传代培养215.3 空斑筛选实验215.3.1 空斑筛选细胞的选择215.3.2 RNA干扰对空斑筛选结果的影响225.3.3干扰素对空斑筛选结果的影响22参考文献：22致 谢24猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建The construction of recombinat Virus for Generating a Novel Genetic Engineering Vaccine Agansit O Type FMDV of Pig摘 要口蹄疫是一种急性
5、、高度传染性的病毒性传染病，虽自20世纪初口蹄疫疫苗已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及动物产品贸易的障碍。由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株PRV TK-/gE-/LacZ+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用人工合成的O型口蹄疫P1基因作为抗原基因，用和泛素（Ub）融合的UbiP1作为另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫3B基因设计的shRNA和具有抗病毒及免疫调节效果的猪IFN-与以上两个功能基因串联，构建了具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和PRV缺失株TK-/gE-/LacZ+共转染细胞，发
6、生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有P1基因、UbiP1、shRNA、IFN-四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因工程疫苗打下基础。关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒AbstractFoot and mouth disease (FMD) is an acute, highly contagious virul infection disease. Although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the disease
7、 still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. The vector virus PRV TK-/gE-/LacZ+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. 朗读显示对应的拉丁字符的拼音This study we selecte synthet
8、ic O type FMDV P1 gene as antigen gene, P1 and ubiquitin (Ub) fusion gene UbiP1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. Then use shRNA designed for 3B gene of FMD, IFN- gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, constructed
9、 transfer vector with four functional gene. Making the transfer vector and the PRVTK-/gE-/LacZ+ cotransfected in cells. After the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genes of P1 gene, UbiP1, shRNA and IF
10、N-, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine.Key words：antigen gene; ubiquitin; interferon gene; recombinant virus 英文缩略词表Abbreviation缩写英文名称中文名称FMDFMDVUbUPSRNAisiRNAshRNASIFIFNPRVNCSAmp DMEM LB PBS PCR SDSEBODEDTAPKVeroDMSOMEMFoot-and-month diseas
11、eFoot-and-Mouth disease virusUbiquitin Ubiquitin-proteasome systemRNA interferenceRNA interference geneRNA interference geneInterference gene fragment-interferon genePseudorabies virusNewborn calf serumAmplicillumDulbeccos Modified Eagle MediumLuria-Bertani medium Phosphate buffer solutionPolymerase
12、 chain reactionSodium dodecylsulphateEthidium bromideOptical densityEDTA Disodium SaltPig kidney cellsAfrican green monkey kidney cellsDimethyl sulfoxideMinimal Essential Medium 口蹄疫口蹄疫病毒泛素泛素蛋白酶系统小RNA干扰小RNA干扰基因小RNA干扰基因干扰基因区段干扰素基因伪狂犬病病毒新生牛血清氨苄青霉素改良Eagle培养基LB培养基磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠溴化乙锭光密度乙二胺四乙酸猪肾细胞非洲绿猴
13、肾细胞二甲基亚砜微小型培养基III1前言1.1口蹄疫的基本特征1.1.1口蹄疫病毒基本概念口蹄疫(Foot-and-month disease, FMD)是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus, FMDV）感染引起的人畜共患的急性、烈性传染病，该病全世界分布广泛，主要感染偶蹄类，一旦爆发常造成巨大的经济损失。由于存在制作灭活苗灭活不彻底和毒力返强造成的潜在危险，开发新型基因工程疫苗已引起人们的重视。1.1.2口蹄疫病毒生物学特征口蹄疫病毒呈球形，正二十面体结构，直径20-25nm;无囊膜，对酸碱敏感，口蹄疫病毒粒子由衣壳和病毒核酸构成，衣壳由60个不对称的亚单
14、位组成，每个亚单位含一分子的VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP4位于病毒颗粒内部。FMDV属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，有7个血清型，即O，A，C，SAT 1, SAT 2, SAT 3和Asia型(Rodriguez and Grubman, 2009)，各个血清型间无交叉反应（陆承平等，2005），病毒的这种特性，给其检疫、防疫带来极大的困难。FMDV基因组为具有感染性的单股正链RNA，大小约8.5kb，只有一个开放的读码框(open reading frame, ORF)，两侧各有一个非编码区(non coding region, NCR)。开放读码框首先翻译为一个多聚蛋白，经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白以及一些中间体。FMDV基因组P1区编码结构蛋白，P12A前体物在3C蛋白酶作用下形成由VP4-VP2，VP3和VP1组成的原体。5个原体组成一个五聚体，十二个五聚体组装成包含RNA的前病毒粒子或者缺乏RNA的空衣壳。在感染细胞中，FMDV 3C蛋白酶基因编码的蛋白能催化加工P12A前体衣壳蛋白为VP0、VP1、VP3，这三种蛋白能相互作用形成5S原体，成为病毒粒子结构的组件，形成病毒样颗粒，这
