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1、MXC 对小鼠离体培养卵巢颗粒细胞凋亡的影响(一)作者：王宝平，马向东，马佳佳，陈必良【摘要】目的：研究甲氧滴滴涕（MXC）对颗粒细胞凋亡的影响，探讨 MXC 对雌性小鼠性腺毒性的作用机制 .方法：以孕马血清（ PMSG）处理的雌性昆明小鼠为模型 ,制备颗粒细胞悬液 ,以不同浓度的 MXC（ 1.25,2.50，5.00 和 10.00 g/mL）对其作用 24，48h 后,应用 TUNEL法及流式细胞术 ,检测 MXC 对离体培养颗粒细胞凋亡的影响 .结果：体外培养的颗粒细胞存在自发性凋亡，对照组和MXC不同浓度实验组的颗粒细胞都有不同程度的体积变小、细胞浓缩、变圆、离壁等类似凋亡的特征 .
2、MXC1.25g/mL浓度组凋亡的颗粒细胞最少,其余 3 个实验组随MXC 浓度的升高 ,凋亡细胞也逐渐增多 ,MXC10.00 g/mL浓度组的颗粒细胞凋亡数量显著高于对照组和其他各组(P0.05).采用 3末端原位标记法在细胞中检测到棕色深染的凋亡颗粒细胞；流式细胞术分析结果显示处于早期凋亡的细胞所占百分率明显升高 (最高达 53.5%).结论：环境污染物高浓度 MXC 可抑制除血清后体外培养的颗粒细胞生长 ,导致颗粒细胞凋亡 ,它的作用是双向的并具有剂量依赖性 . 【关键词】甲氧滴滴涕 ;卵泡颗粒细胞 ;细胞凋亡 ;小鼠【Abstract】AIM:Toinvestigatetherela
3、tionshipbetweenfemalegonadtoxicityofmethoxychlor(MXC)onmouseandtheapoptosisofgranulosacells.METHODS:Pregnantsedasmodelsandgranulosacellsuspensionswereprepared.MXC(1.25,2.50，5.00，10.00 g/mL)wasaddedtoculturedcellsafter24,48hofincubation.Theeffectof MXConapoptosisofgranulosacellswasassessedbyTUNELmeth
4、odandflowcyt ometry.RESULTS:Therewasspontaneousapoptosisintheculturedgranulosacesacacellsincreasedgraduallyinother3testgroupswiththeincreasingconcentratioin10.00 g/mLgroupthanthatinothergroups(P0.05)poptoticsignalswerede.AtectedbyDNA3.CONCLUSION:AhigherconcentrationofMXCmayserveasanimportantendocrin
5、edisruptingchemical(EDC),mediatingmousegranulosecellapoptosisinvitroafterFBSwasremovedfrommedium.Theeffectisbidirectionalandconcentrationdependent.【Keywords】methoxychlor;granulosecell;apoptosis;mouse0 引言甲氧滴滴涕 (methoxychlor,MXC)是一种被人们主动投放于环境中的数量最大、毒性最广的化学物质，因其杀虫效果明显，被人们广泛应用于水果，蔬菜和园林中杀虫 .近年来，MXC的生殖毒性作
6、用不断被发现 1,有研究表明长期接触MXC可导致生育能力下降 2-3和异常胚胎细胞的形成 4，但其生殖细胞的毒性作用机制仍不清楚，有关是否对卵泡颗粒细胞的生存具有影响的报道少见.本研究以小鼠离体培养的颗粒细胞为模型，观察具有雌激素样作用的环境污染物MXC对颗粒细胞存活的影响，以探讨MXC的雌性生殖细胞毒性作用机制.1 材料和方法11 材料健康，尚未性成熟的雌性昆明小鼠 40 只，体质量 1822g（第四军医大学实验动物中心） ；甲氧滴滴涕（批号： 49054，美国 Sigma 公司）；DMEM/F12 干粉细胞培养基， 无脂肪酸牛血清白蛋白 （BSA）（美国 Gibcol 公司）；已二胺四乙酸
7、（ EDTA）、孕马血清 (PMSG）（天津生物制品公司）；无 Ca2+,Mg2+磷酸盐缓冲液（ PBS）（北京中杉金桥公司）；3末端原位细胞凋亡检测试剂盒、多聚赖氨酸、DAB 显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司 )；流式细胞仪（美国 EPICS公司） . 12 方法121 小鼠颗粒细胞的制备及原代培养参照文献 5的方法制备颗粒细胞，选取小鼠，皮下注射 PMSG， 10U/只，饲养温度 22， 12h 光照，12h 黑暗，允许自由饮水和摄食 .48h 后颈椎脱臼处死， 无菌条件下迅速取出双侧卵巢，用 PBS（-）清洗 3 次，在体视显微镜下除去卵巢周围包膜及脂肪组织 .将卵巢置于培养液中，
8、 37孵育15min.然后在解剖镜下用不锈钢针刺破排卵前卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入 1g/L 透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离，过 200 目筛网， 1000r/min 离心 5min.弃去上清后，用培养液（含0.5g/LBSA； 5g/L 蔗糖； 6.8mmol/LEDTA），垂悬细胞沉淀.3750mL/LCO2孵箱中孵育 15min，然后用培养液洗涤细胞 3 次，1000r/min 离心 5min.采用文献 6的方法用台盼蓝排斥法检查活细胞比率（ 85%左右），细胞用一定量的无血清培养基（含100U/L 青霉素； 100g/mL链霉素； 0.5g/LBSA）稀释并用血细胞
9、计数法计数，调整细胞密度，将细胞分别接种于两个 250mL 无菌的培养瓶中 .置于 3750mL/LCO2培养箱中预培养 .122 实验分组将细胞分为对照组：含 0.5g/LBSA的 DMED/F12细胞培养液和四个 MXC 不同浓度实验组（ M1M4 组）：MXC 含量分别为1.25,2.50,5.00，10.00 g/mL,每组均设 4 个重复 .12 3TUNEL 法检测颗粒细胞凋亡将颗粒细胞接种于铺有盖玻片的100mm 培养皿，孵育 24h 后培养液换为不同终浓度的 MXC应用液，分别于第 12,24 和 48h 后收集颗粒细胞爬片，用 40g/L 多聚甲醛固定 1h，置于新鲜配置 3
10、0mL/LH2O2中，室温处理 10min，然后加入标记缓冲液（ LabelingBuffer）20L/片，以保持切片湿润 .置样品于湿盒中， 37标记 2h.加封闭液 50L/片，室温 30min，甩掉封闭液，不洗 .加入 TUNEL反应混合物， 37湿盒中反应1h，再加入稀释后的SABC50L/片,37反应 30min.DAB 显色液显色，自来水冲洗，苏木素浅染，脱水，透明，封片（每次反应间隔均用 TBS洗 3 次） .阴性对照为在标记反应混合物中不加脱氧核糖核苷酸末端转移酶（ TdT酶），其余操作步骤相同 .病理图像分析仪观察 (阳性反应细胞核呈棕黄色 ,颗粒清晰，定位准确；阴性反应细胞
11、呈兰紫色 ),拍照 ,镜下随机计数 10 个视野细胞 ,计算阳性细胞数占总细胞数目的比例,求其均值即为卵巢细胞凋亡指数(apoptosisindex,AI).124AnnexinV/PI 双染流式细胞仪检测早期凋亡率将250mL 培养瓶中的颗粒细胞以1106个/ 瓶转接种于 50mL 无菌的培养瓶中，孵育 24h后培养液换为不同终浓度的MXC 应用液， 24，48h 后收集卵巢颗粒细胞，将培养瓶中的原培养液弃去 ,加入少量的 2.5g/L 胰酶 ,清洗后弃去 ; 再加入适量的 2.5g/L 胰酶 ,在倒置显微镜下观察 ,见细胞稍变圆时 ,立即竖起培养瓶 ,停止胰酶作用 ,弃去胰酶 ;每孔各加入 1mL 的磷酸盐缓冲液(PBS),用吸管反复吹打 ,直至细胞成单细胞悬液为止 ,移入离心管中，1000r/min 离心 5min，弃上清液 .用 4预冷过的 750mL/L 乙醇固定 ,4 保存 ,至少固定 18h,用时 1000r/min 离心 5min,弃去无水乙醇，用 PBS洗细胞 2 次后，调整细胞浓度为 1106/mL,取 1mL 细胞悬液 ,用 PBS洗 3次之后 ,参照文献7的方法采用及PI染色后上机操作,以未染色细胞将机器调零， 以单染管和PI 单染管作基准参照，选取散点图作直观显示，即可对细胞早期凋亡进行检测,并利用 MCYCLF软件对细胞凋亡率进行分析.
