蛋白定量分类

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1、蛋白质含量测定的方法一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法含氮有机物与浓硫酸共热,即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱 化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含 量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：H2NCH2COOH+ 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸 溶液，滴定则用强酸。计算所得结果

2、为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如 欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。二、双缩脲法(Biuret法)蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质与Cu2+形成紫色 络合物，此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸 成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为110ug蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜 色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速， 但并不需要十分精确的

3、蛋白质测定。三、Folin酚试剂法(Lowry法)这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂配 制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：？在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。？Folin一酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还 原，产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物)。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的含量成正比。Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基

4、本步骤。以后在生物化学领域得 到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长， 要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的 溶液，只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度

5、较高，显色后会色浅， 则必须提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时，加Folin-酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin 一酚试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20250mg。四、紫外吸收法由于蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定。紫外吸收法简便、灵

6、敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，利用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量 时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适 于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌吟、嘧啶及核酸等吸收紫 外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以 适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的 结果还是存在一定的误差。此外，进行紫

7、外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。五、考马斯亮兰法（Bradford法）1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原 理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨 基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结

8、合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：(1) 灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋 白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质一染料复合物有更高的消光系数，因而光吸 收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。(2) 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于 染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定， 且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格 地控制时间。(3) 干扰物质少。如干扰

9、Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘 油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：(1) 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋 白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g一球蛋白为标准蛋白质，以减少 这方面的偏差。(2) 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷 基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。(3) 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来 测定未知蛋白质的浓度

10、。六、BCA比色法在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还愿为Cu+再与BCA试剂(4, 4-二羧酸-2, 2-二喹啉钠) 生成紫色复合物，于562nm由最大吸收，其强度和蛋白质浓度成正比。此法的优点是单一试剂、终产物稳定，于lowry法相比几乎没有干扰物质的影响。尤其是在TritonX-100, SDS等表面活性剂中也可以测定。其灵敏度范围一般在101200 ug/ml。表五种蛋白质含量测定方法的比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.21.0mg氮，误差为2%费时810小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋

11、白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret法）灵敏度低120mg中速2030分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50100mg快速510分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin 酚试剂法（Lowry法）灵敏度高5mg慢速40 60分钟双缩脲反应；磷钼酸一磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法（Brad

12、ford法）灵敏度最高15mg快速515分钟强碱性缓冲液;考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nmTritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化从以上表格中可以得出，不同的方法有不同的特点和优势，如紫外吸收法测定时间快。但是综合起来，最后一种考马斯亮蓝法(Bradford法)效率最高，无论是测定时间，灵敏度还 是受干扰程度，都是比较占优势的。三、磷酸盐缓冲液概要PBS在医学词汇中表示磷酸盐缓冲液，pH=7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷 酸氢钠、磷酸二氢钠、氯化钠以及氯化钾。PBS缓冲液的配制 储备液0.2M A液二水合磷酸

13、二氢钠6.2404g蒸馏水200mL0.2M B液十二水合磷酸氢二钠71.628g蒸馏水1000mL 0.1M PB (pH 7.27.4)的配制0.2M A 液 95mL0.2M B 液 405mL蒸馏水500mL 0.1M PBS (pH 7.27.4)的配制0.1M PB 1000mLNaCl 8.5g 0.01M PBS (pH 7.27.4)的配制0.2M A 液 47.5mL0.2M B 液 202.5mL蒸馏水4750mLNaCl 45g1N NaOH 10mL测pH值应在7.27.4之间，若偏离此范围，用0.1N的HCl或NaOH调整。0.1M的用来稀释一抗，0.01M的用于试验中漂洗。