miRNA的生物合成过程

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1、MicroRNA(miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码RNA,它们主要参与基因转录后水平的调控。miRNA的调控功能是十分重要的，近来发现它们在果蝇的细胞增殖、死亡及脂肪代谢,线虫极性的形成,哺乳动物的造血干细胞的分化等过程中起了重要的调控作用。在植物中，miRNA还参与了叶子与花的发育过程。动物(尤其是人)miRNA的生物合成过程已经初步得到了诠释。首先，miRNA基因的初级转录产物(pri-miRNA)在细胞核中被RNaseIIIDrosha切割成为前体miRNA(pre-miRNA)。在最初的剪切后，pre-miRNA在转运蛋白exportin-5的作用下由核内

2、转到胞质中，然后由另一种RNaseIIIDicer进一步切割产生成熟的miRNA。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)复合体，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。1miRNA基因的转录与转录初产物的剪接大多数miRNA基因与蛋白质基因距离比较远，它们可能有自己的启动子可以进行独立的转录。但是也有相当多的miRNA基因，人有1/4的miRNA基因是位于蛋白质基因的内含子当中的通常miRNA基因与内含子的转录方向是一致的，这就说明这些基因大多是与寄主蛋白基因共转录的，然后再从这些蛋白质基因的内含子中剪切出来。并且同一类miRN

3、A基因在不同生物体中的寄主基因往往是保守的同一类蛋白质基因。正是由于miRNA与其寄主蛋白基因是共表达的，而使它们的联系在进化过程中也保守地保存下来。还有一些miRNA基因是成簇分布在染色体上，它们通过一个共同的启动子转录成为多顺反子。虽然这种形式在线虫和人的miRNA基因中比较少见，但是果蝇的miRNA基因中一半是成簇的。而且这些成簇的miRNA基因经常是彼此相关的。例如人的mir-15a-mir-16基因簇是位于13号染色体上的一个抑癌基因中，而这一位置在B细胞与T细胞白血病中均产生了结构的畸变。经研究发现，这两个miRNA确实与白血病的发生有关。目前，我们对miRNA基因如何转录成为pr

4、i-miRNA还知之甚少。研究发现RNA聚合酶II和III均可以参与miRNA的转录。位于蛋白质基因内含子中的miRNA基因毫无疑问是由聚合酶II进行转录的。虽然大多数其他miRNA基因缺少加多聚腺苷酸尾的信号，还有一些间接的证据证明它们也有可能是聚合酶II的转录产物：a.有些pri-miRNAs相当长，有时超过1kb,这比聚合酶III的转录产物长很多。b.大多数pri-miRNAs最后一个碱基为尿嘧啶，而这通常被认为是聚合酶III提前中止的转录产物。c.许多miRNA基因的表达在发育过程中是变化的，这种表达变化通常在聚合酶II的转录产物中比较常见。d.将某些miRNA基因的5区域与报告基因的

5、开放阅读框相融合，可以使报告基因得到表达，说明这种miRNA基因是可以通过聚合酶II转录的。e.对于线虫let-7miRNA的研究表明，let-7pri-miRNA有多聚腺苷酸尾，确实是由聚合酶II的转录产生。另外，聚合酶III也可以参与miRNA基因的转录。例如，给miRNA基因加上聚合酶III的启动子由聚合酶III进行表达，在体内不仅可以有效地表达出这些miRNA，同时它们还可以行使其功能，这就说明，miRNA的加工及其功能的行使与由何种聚合酶参与其基因的转录并没有必然的联系。对于pri-miRNA转录后加工的研究十分有限，只有对线虫let-7miRNA的研究比较完整。Bracht等发现了

6、两种长的5端加帽，3端加多聚腺苷酸尾的let-7pri-miRNA，是由聚合酶I转录产生的。这些转录产物在5端有剪接引导序列，它们可以作为反式剪接的底物。实验证明，初级转录产物的反式剪接对于成熟的let-7RNA的产生十分重要，其序列和结构的变化对于接下来的剪切反应影响很大，含有成熟的let-7RNA发夹结构前体，其附近序列的二级结构在剪接前后发生了变化，这一变化延长了let-7RNA的发夹结构前体末端的茎区，这一结构也是RNaseIIIDrosha的底物类似物。同时，初级转录产物的反式剪接也去掉了对下一步剪切造成空间阻抑的序列。因此，对miRNA初级转录产物的剪接可以显著改变发夹结构前体周围

7、的序列及结构，从而有利于对miRNA前体的进一步剪切。Pri-miRNA的第一步剪切是由核糖核酸酶IIIDrosha完成。其产物是70nt的发夹结构前体(pre-miRNA)。这一切割反应不仅切出了成熟的miRNA的3末端，而且使3末端有2nt的突出，这正是由核糖核酸酶III进行切割的特征。而且，切割反应并不是发生在发夹结构前体的基部，而是基部上的几个碱基处。Drosha进行切割的特异性序列还没有找到，但是前体基部的螺旋结构对于切割是十分重要的，因为在前体的茎区插入和删除序列将导致切割位点的改变。最新的研究发现，参与这一切割过程的是一个多蛋白质复合体，Drosha是其中的重要成分，起到切割的作

8、用。在这一复合体中，还存在一种双链RNA结合蛋白Pasha(partnerofDrosha)。在果蝇细胞和线虫中抑制Pasha的表达，干扰了pri-miRNA的剪切，使细胞内pri-miRNA的积累增多，成熟miRNA的量减少。Pasha在复合体中的具体功能还不清楚，但是它可能参与识别miRNA的初级转录产物，将它们集中到复合体中，有利于其被Drosha切割。另外，Pasha可能对pri-miRNA在复合体中的定向有帮助，从而有利于Drosha在特定位点的切割。2 miRNA前体的转运出核由于动物的pre-miRNA需要胞质中的Dicer酶进行进一步加工，转运出核就成为miRNA成熟过程中必需

9、的一步。这一过程是通过依赖RanGTP/exportin5的转运机制来完成的。在细胞核中，RanGTP的浓度较高，Exportin5(Exp5)就可以促进pre-miRNA从Drosha复合体中释放，并且与之结合，将其带到核外。由于胞质中RanGTP的浓度较低，Exp5就释放pre-miRNA，使之与Dicer结合进行下一步的切割。在运输过程中，miRNA前体的3突出将有利于其进入运出核的途径。3 Pre-miRNA的剪切与miRNA的成熟在动物细胞核中，Drosha的切割产生了成熟miRNA的一端(3端)。另一端的切割成熟是由胞质中另一类核糖核酸酶IIIDicer切割产生的。Dicer首先是

10、在研究小干扰RNA(siRNA)引起的基因沉默中被发现的，后来发现它在miRNA的成熟过程中也起着重要的作用。Dicer参与miRNA的成熟过程与RNA干扰中产生双链RNA的过程很相似：首先Dicer识别pre-miRNA的双链部分，其与茎环基部的5端被磷酸化、3端有突出的结构有很高的亲和力。然后，茎环基部的两圈螺旋解开，Dicer对两条链都进行切割，将前体的其余部分切掉，生成5端磷酸化、3端有2nt突出的类似于siRNA的不完全配对的双链。这条RNA双链是由成熟miRNA与miRNA*组成的(见图1a中的第4步)。miRNA*是pre-miRNA上的一段RNA,其位置恰好与成熟的miRNA相

11、对。虽然Dicer在对pre-miRNA的加工过程中能够产生RNA双链中间体，但是这种中间体通常寿命比较短暂而不易被探测。不过，如果大量的前体均可产生并只产生一种miRNA，则其双链中的星号链也可以成为成熟的miRNA。就现有的动物miRNA成熟的模型来看，最初由Drosha介导的切割特异性决定了miRNA前体中Dicer的切割位点，从而决定了成熟miRNA的两端。由Drosha而不是Dicer决定这一特异性是由于研究表明Drosha对非特异性双链RNA的切割效率很差，而Dicer可以没有序列依赖性地切割任何RNA双链。并且Drosha的切割还依赖于pri-miRNA茎环基部的二级结构，以及茎

12、环基部外侧125nt范围内的序列。4植物miRNA的成熟过程植物miRNA的成熟过程与动物有所不同，因为植物中没有Drosha的同源类似物。在植物中通常很难检测到pre-miRNA,即使在DCL1突变的植物中也很少检测到。DCL1是植物miRNA成熟过程中类似于Dicer的蛋白质，它是位于核内的。这就说明在植物中可能有其他酶（很有可能是DCL1）行使了Drosha的功能,对miRNA的转录初产物进行第一次切割,并且决定了成熟的miRNA的序列。在miRNA离开细胞核之前，DCL1（或其他酶）又进行了第二次切割,相当于动物细胞中Dicer对pre-miRNA的切割。然后,可能是由HASTY（Ex

13、portin-5在植物中的同源类似物）负责将miRNA：miRNA*双链转运出细胞核（图1b中的第4步）。由于经核内连续两次切割，在植物中才难以检测到pre-miRNA样的RNA。拟南芥（Arabidopsisthaliana）作为植物中的一种模式生物，对其miRNA的研究是最多的。最近，对拟南芥miR163的研究进一步揭示了植物miRNA的成熟过程。拟南芥的基因组编码4种Dicer样的酶（DCL1-DCL4）。其中DCL1是与miRNA的积累相关的，DCL2和DCL3分别参与了由病毒引起的小干扰RNA（siRNA）和内源性siRNA（例如反转座子siRNA）的合成。拟南芥miR163是单独转

14、录的，由RNA聚合酶II催化合成，其转录初产物pri-miR163需要经过核糖核酸酶III样的酶切割三次才能成为成熟的miRNA。第一步是在pri-miR163的茎环结构的根部进行切割，得到长miR163前体（pre-miR163），第二步是对长pre-miR163中成熟的miRNA的3根部进行剪切，得到短的pre-miR163,最后是由短的前体切割出成熟的5端成为成熟的miRNA（图2）。有趣的是，在整个剪切的过程中，四种小分子都可以被释放出来。进一步实验证明，拟南芥的DCL1至少可以对第一及第二步切割反应进行催化，即对pri-和pre-miRNA都可以切割。另外，第三步的切割反应可能也是DCL1催化的。所以拟南芥的DCL1蛋白参与了miRNA成熟的全过程。由于拟南芥的DCL1蛋白有两个类核定位信号，因此植物的miRNA的成熟是在细胞核中完成的。同时，研究表明，植物DCL1蛋白的双链RNA结合区在决定第一次和第二次的切割位点时是十分重要的。在dcl1-9_dcl1-9的突变体当中仍然有21nt的RNA片段产生，是因为虽然dcl1-9蛋白在随机位置上剪切pri-miRNA163，但是却能准确量出第一次切割的位置到下一次切割的位置为21nt。