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1、膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 或者：利用具有一定选择性透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化。离子交换: 在吸附剂与溶液间发生离子交换，即吸附剂吸附离子后，它同时要放出等当量的离子于溶液中。亲和层析：是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。过滤：是在外力作用下，利用过滤介质使悬浮液中的液体通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一种单元操作。 或者：利用薄片形多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。 重结晶：是利用杂质和结
2、晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。分辨率：也称分离度。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比。晶体：形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。初级分离：指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。截留率 ：表示膜对溶质的截留能力，可用小数或百分数表示。 （真实截留率和表观截留率） 自溶：通过
3、调节温度、PH值或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法，也是一种酶溶法。保留体积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时，VM可由 tm与流动相体积流速F0(ml/min)的乘积计算。理论塔板高度：单位理论塔板的长度称为理论塔板高度。它等于色谱柱长度除以理论塔板数。用理论塔板数与板高表示柱效率时是等价的。过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出。 分子筛层析法：又称凝胶过滤层析法，
4、是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。阻滞因数：是在色谱系统中溶质的移动速度和一理想标准物质（通常是和固定相没有亲和力的流动相）的移动速度之比，即 R=溶质的移动速度 / 流动相在色谱系统中的移动速度 分离因子：某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数，又称质量分布比。即=q / Ct （Ct为溶质总浓度，包括游离和被结合）。膜组件：由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这些部件的容器构成的一个单元，又称膜装置。亲和吸附:是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用,从而实现分离. 扩散层：在胶粒周围的一部分阳离子由吸附层表面分布至胶粒阴电荷不能吸引的最小距离所形成的非牢固结合
5、层。体积浓缩倍数：即料液体积与溶剂体积的比值。正相色谱:是指固定相的极性高于流动相的极性,因此,在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快,先从柱中流出来.比较微滤、超滤、反渗透的区别和共同点？答：超滤(UF)和微滤(MF)都是利用膜的筛分性质,以压差为传质推动力。UF膜和MF膜具有明显的孔道结构，主要用于截留高分子溶质或固体微粒。UF膜的孔径较MF膜小，主要用于处理不含固形成的料液，其中相对分子质量较小的溶质和水分透过膜,而相对分子质量较大的溶质被截留。因此，超滤是根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别进行分离的方法。 微滤过程中，膜两侧渗透压差
6、较小，所以操作压力比反渗透操作低，一般为0.11.0MPa。微滤一般用于悬浮液（粒子粒径为0.110）的过滤,在生物分离中,广泛用于菌体细胞的分离和浓缩。微滤过程中膜两侧的渗透压差可忽略不计，由于膜孔径较大，操作压力比超滤更低，一般为0.05.5a。反渗透：溶质浓度越高，渗透压越大。如果欲使高浓度溶质一侧溶液B中的溶剂（水）渗透到纯水侧A，在B侧所施加的压力必须大于此渗透压，这种操作称为反渗透。传质推动力是压差；分离原理为筛分。层析分离技术 1. 根据机理不同，色谱分离可分为那几种？简述各种色谱分离的基本原理。与其他分离技术相比，色谱分离技术有何特点？答：按分离机理不同分类：吸附层析、分配层析
7、、凝胶过滤层析（1）吸附层析：混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。（2）分配层析：其固定相和流动相都是液体，其原理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。其中，固定相是由固定液与载体结合后形成的。（3）凝胶过滤层析：根据物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称分子筛色谱。由于大分子和小分子在通色谱柱时，所通过得路径不同（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出色谱柱的时间不同，从而得到分离。其固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。与其他分离技术相比，色谱分离技术的特点：分离效率高，应用范围广，高灵敏
8、度的在线检测，快速分离，过程自动化操作。2.比较分配色谱中的分配系数、吸附色谱中分离因素及凝胶色谱中的分配常数有何异同点？答：在层析过程的某一时刻，如果流动相中样品的浓度为Cm，固定相中样品的浓度为Cs，则分配系数K定义为：K=Cs/Cm。为了更好地描述层析过程中Cm与Cs之间的关系，在分配层析中直接用分配系数K表示，在吸附层析中衍生出分离因数，在凝胶层析中衍生出分配常数Kd。（1）分配系数在分配层析中，分配系数：类似于溶剂萃取中的分配系数K=cs/cmcs、cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度，在一定温度下，当溶质的浓度较低时，K为常数-线性色谱；当溶质的浓度较高时，K为溶质浓度的函数-非
9、线性色谱。? 在层析过程中，分配系数较大的组分，迁移速度较慢；而分配系数较小的组分，迁移速度较快。因此，分配系数相差较大的两种物质很容易通过层析过程进行分离。（2）分离因数分离因数：某一瞬间被吸附的溶质量占总量的分数（表示）： =cs/(cs+cm)01：?当=0时，此种溶质不与固定相产生吸附作用，或固定相已无空余的结合位点，此时溶质随流动相以同样的速度移动；当=1时，溶质全部被吸附在固定相上，且不随流动相移动。?在柱色谱分离中，有效的分离通常要求值至少为0.8。（3）分配常数在凝胶层析中，引入一个分配常数Kd，它表示某溶质分子可以进入凝胶颗粒内部空隙的分数。0Kd1：当Kd=0时，意味着溶质
10、分子完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外，而最先被洗脱；当Kd=1时，意味着溶质分子完全不被排阻，可以自由进入所有凝胶颗粒的微孔中，而最后被洗脱。在实际操作时，有时会出现Kd1的情况，表明除了凝胶的分子筛作用外，还存在着吸附作用。3 色谱的分离度是如何定义的？它与哪些因素有关？答：Rs=（两峰之间的距离）/（平均峰宽）Rs表示色谱峰的分离度，Rs1，两个峰被完全分开，即为最佳的分离条件。分离度取决于分离效率和选择性：分离效率取决于峰宽；选择性取决于两峰之间的距离。4. 离子交换色谱的基本原理是什么？常用的离子交换剂有哪几类？答：原理：利用离子交换剂作为层析支持物（固定相），由于带有不同电荷的蛋白质与
11、固定相间的静电作用力（吸附力）不同，从而达到分离目。最为常见的包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换琼脂糖等。5. 离子交换色谱的洗脱方式有几种？分别在什么情况下适合?按操作方式：恒定洗脱(isocratic elution)，分步洗脱(stage elution)，梯度洗脱(gradient elution)按洗脱机理：改变缓冲液盐浓度，改变缓冲液pH，改变缓冲液盐浓度和缓冲液pH添加剂：表面活性剂、尿素、盐酸胍洗脱体积：5倍床体积以上6.亲和色谱主要有哪几部分组成？其核心部分是什么？为什么要引入接枝手臂？在重组蛋白的分离纯化中，如何通过上游技术来简化下游的分离纯化技术？
12、答：主要有载体（担体），配体与目标物，接枝手臂组成，其核心部分是配体的选择和亲和吸附的合成。接枝手臂的作用：当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。需要在配基与载体连接一个接枝手臂，以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子有效的亲和结合。7. 凝胶过滤色谱的原理是什么？有何特点？答：原理：凝胶过滤层析又称凝胶排阻色谱, 分子筛色谱法, 凝胶过滤法等。利用凝胶过滤介质为固定相，根据物料中溶质相对分子质量的差异的液相色谱法。特点：（1）操作方便, 条件温和,不会使物质变性；（2）色谱介质不需再生,可反复便用。（3）分离效率高
13、，回收率较高。（4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。（5）分辨率较低，需采用细长柱。（6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需进行浓缩8. 凝胶过滤色谱的凝胶特性参数有那些？理解它们的具体含义。答：(1) 排阻极限(exclusion limit) 是指不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量。(SephadexG-50的排阻极限是30kDa）。(2) 分级范围(Fractionation range) 它指出了当溶液通过凝胶柱时,能够为介质阻滞并且分离的溶质分子量范围(SephadexG-50, 它的分级范围为1500-30000)。(3) 吸水量(Water regains)
14、 1g干凝胶所吸收的水分称为吸水量（SephadexG-50的吸水量为5.00.3g ）。溶胀率=吸水量100%。(4) 凝胶粒径凝胶颗粒一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响（粒径越小，其分离效率越高）。100-200目(50-150m)(5) 床体积(Bed volume ) 表示1g干胶在溶胀后所具有的最后体积(SephadexG-50的床体积为9-11ml/g 干凝胶)(6) 空隙体积(Void volume) 表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间即V0(用平均分子量为2000kDa蓝色葡聚糖测出) 。9. 凝胶过滤色谱的操作过程与吸附色谱有那些主要区别？答：吸附色谱固定相通常是活性硅胶
15、、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。10. 凝胶过滤色谱主要应用于那些方面？答：（1）脱盐及缓冲液的更换：由于蛋白质与盐的分子量相差较大，因此，很容易通过凝胶过滤色谱将二者分开；了更换缓冲液，可将平衡缓冲液和洗脱缓冲液使用需更换的缓冲液，这样，脱盐的同时即可将样品缓冲液进行更换。? 脱盐柱体积可从1ml2,500L;脱盐柱的型号常用SephadexG-25（2）分级分离：当目标蛋白大于凝胶的排阻极限，而杂质处于排阻范围内时，容易得到较纯的目的蛋白；但事实上，由于凝胶的孔径具有一定的分布，要想将目标蛋白和杂蛋白完全分开，具有一定的难度（3）分子量的测定：在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数呈线性关系（KD=a-blgMW），所以，凝胶过滤色谱可用于未知物质相对分子质量的测定。11. 疏水作用色谱的基本原理是什么？答：疏水性作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography, HIC）是利用表面偶联疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白
