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1、#/201. 概述2. 验证范围3. 验证目的4. 验证参考文件5. 验证小组名单6. 验证小组职责7. 验证内容8. 结论与评价再验证周期#/ 201概述1.1. 本公司的洁净区分为A级、B级、C级和D级，拟定用于洁净区表面消毒的有三 种消毒剂：75%乙醇、0.1%新洁尔灭溶液、2%甲酚皂溶液。本次验证方案将选用以上 3 种消毒剂分别进行验证试验。1.2. 消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期见下表：序号名称消毒对象消毒方法有效期175%乙醇用于设备表面、器具和手消毒。采用擦拭或喷洒方式密闭保存 7天20.1%新洁尔火溶液用于地面、墙面、器具、清洁布、 拖布和洁净鞋的消毒采用擦拭或浸泡方
2、式密闭保存 7天32%甲酚皂用于水池和地漏、地面的消毒用于液圭寸密闭保存 7天备注以上消毒剂浓度均为体积分数比。1.3. 作用对象一样的消毒剂每月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。在利用消 毒剂进行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于10分钟，利用消毒剂进行浸泡消毒的不少于5分钟。1.4. 为了确认消毒剂的消毒效力，通过实验室考察部分和现场考察部分分别进行验证。 实验室考察部分，定量悬浮试验法适用于浸泡或液封方式的消毒方法；表面实验法适用 于擦拭或喷洒方式的消毒方法。洁净区设施表面材质有不锈钢、镀锌板及玻璃三种，故 表面试验法选用不锈钢载片、镀锌板及玻璃载片模拟洁净区设施表面进行验证
3、试验。现 场考察试验部分选择冻干车间的配液间（C级洁净区）、灌装间（A/B级洁净区）、灌装间 操作人员手部消毒前和消毒后分别进行取样，测定其微生物数量。1.5. A/B级洁净区使用的消毒剂需经0.22 yn除菌过滤。2. 验证范围本验证方案适用于本公司洁净区的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、 地漏、推车、桌椅等表面以及操作人员双手（手套）的消毒等。3. 验证目的通过消毒剂消毒效果及有效期的确认，科学制订消毒程序，以保证各洁净级别的操 作间及设备外表面、人员手部按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒防止污染的效果。4. 验证参考文件药品生产验证指南（2003版）；医疗机构消毒技术规范（2
4、012年版）；中国药 典（2010年版）;药品GMP指南-无菌药品、现代医药工业微生物实验室质量管理 与验证技术。5. 验证小组名单组长姓名职务/职称部门*经理质量部成员*车间主任生产部*QC主管质量部*QC质量部*QA主管质量部6. 验证小组职责7. 验证内容7.1. 验证前参与实施验证的人员必须已经接受本方案的培训且考核合格。见附表 1。7.2. 验证前准备7.2.1. 菌种7.2.1.1. 试验微生物以金黄色葡萄球菌作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表；大肠杆菌作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；白色念珠菌作为致病性真菌的代表。在上述规定的 菌、毒株的基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可
5、增选其他菌、毒株。7.2.1.2. 75%乙醇、2%甲酚皂为中效消毒剂，0.1%新洁尔灭为低效消毒剂，均不具备 杀灭细菌芽抱功能，根据上述内容，本次验证所用菌种见下表：序号名称丿予列号类别1金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003细菌2大肠埃布困CMCC(B)44 102细菌4白色念珠菌CMCC(F)98 001真菌7.2.1.3.可接受标准：标准菌种必须来源可靠、来源可溯、保存方法与条件合适。使用的标准菌种不能超过第五代。7.2.1.4.应确认菌种名称、来源、代数，见附表27.2.2.试剂及培 养基7.2.2.1.选用培养基见下表：予号名称备注1营养琼脂培养基121C，15min灭菌备用2玫
6、瑰红钠琼脂培养基121C，15min灭菌备用3胰酪胨大豆琼脂培养基121C，15min灭菌备用7222稀释液、冲洗液：0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液7223可接受标准：所有试剂、培养基的规格、数量和保存条件满足要求，且在有 效期内；脱水培养基呈流动粉末状，无结块，无潮解，且在有效期内。7.2.24试剂/培养基检查确认记录见附表3。7.3. 消毒剂配制：按清洁剂、消毒剂的配制与使用标准操作程序进行消毒剂配制。7.4. 定量悬浮试验7.4.1. 目的：0.1%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液、2%甲酚皂溶液消毒效力的确认（定 量悬浮试验法）。7.4.2. 菌液制备：取金黄色葡萄
7、球菌、大肠埃希菌接种于营养肉汤培养基中，于30535C培养1824h即得，培养后微生物浓度应不少于10 cfu/ml。取白色念珠菌接种于改 良马丁液体培养基中，于 2328T培养2448h即得，培养后微生物浓度应不少于510 cfu/ml。7.4.3. 将配制好的0.1%新洁尔灭溶液（或75%乙醇溶液或2%甲酚皂溶液）按9ml/支 分注于27支无菌具塞试管中，按照“汾钟组” “ 1（分钟组”和“15分钟组”共3组每组9 支，进行分组编号。557.4.4. 取供试菌液（10cfu /ml的金黄色葡萄球菌菌液，10 cfu /ml的大肠埃希菌菌液， 105cfu /ml的白色念珠菌菌液）1ml按照
8、下表，分别接入到盛有9ml0.1%新洁尔灭溶液（或 75%乙醇溶液或2%甲酚皂溶液）的试管中（已进行10倍稀释），轻轻摇动，混合均匀， 并立即开始计时。菌种名称5分钟组10分钟组15分钟组金黄色葡萄球菌1ml/支，共3支1ml/支，共3支1ml/支，共3支大肠埃布困1ml/支，共3支1ml/支，共3支1ml/支，共3支白色念珠菌1ml/支，共3支1ml/支，共3支1ml/支，共3支7.4.5 .试验方法分别在5分钟、10分钟和15分钟取接种细菌的消毒液，倾入过滤杯滤过，然后各用 0.9%无菌生理盐水50ml清洗滤膜，滤过，重复用50ml0.9%无菌生理盐水的洗涤共3次 取下滤膜，含细菌的膜放入
9、营养琼脂平板内，含真菌的膜放入玫瑰红钠琼脂平板内，含 菌膜面向上。细菌于30-35的生化培养箱内培养3天，真菌于23-28T的霉菌培养箱内 培养5天。培养后在明亮处，对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。7.46阳性对照555分别将10 cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液、10 cfu/ml大肠埃希菌菌液、10 cfu/ml的白 色念珠菌菌液逐级稀释至浓度为 10100cfu/ml，取稀释菌液1ml于平皿中，倾注冷却 至45C营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基混匀，待凝固后于细菌于30-35的生化培养箱内培养3天，真菌于23-28C的霉菌培养箱内培养5天。培养结束后对平板上的 菌落数进行计数，记
10、录计数结果。0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认记录见附表475%乙醇溶液消毒效力确认记录见附表 52%甲酚皂溶液消毒效力确认记录见附表 67.5. 表面实验7.5.1. 目的：由于75%乙醇溶液、0.1%新洁尔灭溶液要通过擦拭消毒，故选用不锈钢载 片及玻璃载片进行表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。7.5.2. 工作菌液制备同742.项下菌液制备。7.5.3. 染菌不锈钢载片制备：将经灭菌的不锈钢载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌含菌量为1X1085X108CFU/ml的菌液0.1ml,并均匀涂布于整个载体表面。滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。每种菌平行
11、制备两个染菌不锈钢载片；染菌玻璃载片制备：因培养皿的材质为玻璃，故用培养皿代替玻 璃载片进行染菌试验。进行菌液滴染前，用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌 面积（50mX 50mm），标注清晰。菌液滴染操作同染菌不锈钢载片制备。7.5.4. 取样7.5.4.1. 试验组：将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为5min、10min、15min,不锈钢载片、镀锌载片及玻璃载片每个作用时间分别制备2个。作用结束后，用接触碟取样（接触碟规格：*55mm,取样面积为25cm2）。取金黄色葡萄球菌 用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟；取大肠埃希菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟；取样白色念珠菌用
12、玫瑰红钠琼脂培养基接触碟。接触碟取样方法：打开接触碟盖，使无菌 培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样面表面均匀接触10秒左右，盖上碟盖。7.5.4.2. 对照组：对照组的活菌浓度同工作菌液的制备。阴性对照：用接触碟在已灭 菌的载片上（未染菌片的载片）按压取样，操作同上。每种载片及每种接触碟平行制备 两份。7.5.5. 培养：将取样金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的接触碟倒置于3035C培养3天计数；取样白色念珠菌的接触碟倒置于 2328C培养5天计数计数。7.5.6. 结果计算：计算试验组和对照组的活菌浓度（CFU/ml）,并换算为对数值（N）， 并按下式计算杀灭对
13、数值：杀灭对数值（KL）=对照组平均活菌浓度的对数值（NO）-试验组活菌浓度对数值（NX）7.5.7. 可接受标准：杀灭对数值（KL）应不低于3个对数单位。75%乙醇溶液、0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认（表面实验）见附表7。7.6.消毒效力现场考察试验7.6.1. 目的：确认消毒剂对相应设施的实际消毒效力。7.6.2. 操作：生产车间岗位操作人员按照洁净区操作间清洁标准操作程序、洁净区水池、地漏清洁标准操作程序、洁净区人员手部卫生清洁标准操作程序、洁净区 清洁用具清洁标准操作程序、洁净区工作服清洁标准操作程序进行清洁消毒。分别 选取如下试验现场：7.6.2.1. 冻干车间的配液间（C级洁净区
14、）顶棚、墙面、地面、工作台面，地漏、水 池；7.6.2.2. 冻干车间的灌装间（A/B级洁净区）顶棚、墙面、地面、工作台面、设备表面；7.6.2.3. 冻干车间灌装间（A/B级洁净区）操作人员手部；7.6.2.4. 冻干车间B级洁净区的工作鞋、清洁布、拖布。7.6.3. 取样检测7.6.3.1. 消毒15分钟后，由QC人员到试验现场，按照冻干 C线洁净区（室）表 面微生物监测标准操作程序进行洁净区表面微生物的取样检测；7.6.3.2. 用浸泡或液封方式（地漏、水池、工作鞋、洁净布、拖布）的采用无菌吸管 取浸泡液或液封液1ml，于胰酪胨大豆琼脂培养基平板培养；7.6.3.3. 灌装间（A/B级洁
15、净区）操作人员，采用75%乙醇进行手部消毒。将配制好并 经过0.22 m除菌过滤的75%乙醇盛装于喷壶中，灌装间操作人员在生产开始时进行手 消毒，间隔5分钟、10分钟、15分钟、20分钟分别进行手指菌取样。7.6.3.4. 连续逐日测定，共测定3次。记录测定结果。7.6.4.可接受标准：所监测的洁净区的微生物均符合各自的洁净级别要求。洁净度级别表面微生物接触碟cfu/碟（设备、设施、工作服）5指手套cfu/手套A级V 1V 1B级55C级25D级5075%乙醇溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表80.1%新洁尔灭溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表92%甲酚皂溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表1075
