《菌株ShigellaflexneriFB5响应氟磺胺草醚蛋白质组学分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《菌株ShigellaflexneriFB5响应氟磺胺草醚蛋白质组学分析（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1菌株 Shigella flexneriFB5 响应氟磺胺草醚蛋白质组学分析摘 要：为明确氟磺胺草醚降解菌的蛋白质组学相关机理，针对实验室前期筛选得到的高效降解菌Shigella flexneriFB5 ，在明确菌株对氟磺胺草醚高效降解的基础上，本研究进行了蛋白提取和双向电泳试验，发现氟磺胺草醚诱导下菌株差异蛋白点13个，通过生物信息学比对得到其功能，根据氨基酸序列设计引物进行PCR扩增，得到氟磺胺草醚诱导下菌株两个相关基因，测序后发现基因F3序列与 E.coli结合蛋白 dps基因同源性是100% ，基因F6序列与沙门氏菌肠溶亚种血清变型索菲亚菌S1635外膜蛋白基因和E.coli SYW
2、004 外膜蛋白基因A 相似度 87%，同时对基因序列进行系统进化树构建，并且推测出基因的理化性质，为阐明该菌株降解机制奠定基础。关键词： 氟磺胺草醚；Shigella flexneri ；双向电泳；PCR扩增Strain Shigella flexneriFB5 response fomesafen proteomicsanalysisAbstract: To clear the proteomics mechanism of fomesafen degrading bacteria, focusing on the highly efficient degrading bacterium
3、Shigella flexneri FB5 screened and obtained in lab, based on the efficient degradation of fomesafen in this strain, protein extraction and two-dimensional electrophoresis were carried out and showed that the strain induced by fomesafen had 13paraproteins, and its function was obtained by bioinformat
4、ics alignment. Based on the amino acid sequence to design primers to be amplified by PCR. Two related genes of strain induced by fomesafenwere gotten, after sequencing, it was found that the homology between the gene F3 sequence and the dps gene of E.coli-binding protein was 100%. The similarity of
5、gene F6 sequence, salmonella enteric subtype serotype S1635 outer membrane protein gene and E.coli SYW004 external membrane protein gene A was 87%, at the same time carrying out systematical phylogenetic tree construction for the gene sequence, and speculating the physical and chemical propertiesof
6、genes,which can be used to lay the foundationforclarificationof the degradationmechanism of the strain.Key words: fomesafen; Shigella flexneri;two-dimensional electrophoresis;PCR amplification1 黑龙江省科技创新创业共享服务平台哈尔滨市应用技术研究与开发项目（青年后备人才A 类，编号：2015RAQYJ009 ）11-13 ，起到重要作用。1. 引言随着人们生活水平日益提高，工农业生产中除草剂的使用越来越
7、广。除草剂的大量使用在给人们带来巨大利益收益和生活收益的同时，也会产生一些负面影响，如环境污染、生活在土壤中的微生物数量改变、杂草分群落生长、药害作用产生，以及杂草抗药性产生1 。长残效除草剂不容易分解，短的存在时间可达1-3 年，长的存在时间可超过4-6年 2-4 。氟磺胺草醚是一种二苯醚类除草剂，主要用于防治大豆、花生田产生的杂草，作用机制是抑制合成原卟啉原氧化酶， 使敏感植物的细胞膜被破坏，最终导致细胞死亡 5 。这类除草剂在土壤中使用后残留在环境中时间较长，对后茬敏感作物产生非常严重的药害作用。除草剂的危害日益严重，大大影响了国家的经济效益 6-8 。生物修复是随着生物学发展的一种新技
8、术，其主要是利用生物特有的分解有毒有害物质的能力达到治理环境污染的目的。氟磺胺草醚长期施用于大豆田防除阔叶杂草，有着十分严重的残留问题，氟磺胺草醚在土壤中的降解主要是通过水解、微生物降解等方式，有关氟磺胺草醚污染土壤的生物修复研究报道也越来越多，其中梁波 9 等从 大田 土壤 中分离出一株高效降解细 菌ZB-1 ，我们实验室从氟磺胺草醚污染土壤中分离出一株高效降解菌株门多萨假单胞菌 ( Pseudomonas mendocina sp ) FB8 10 ，细菌是通过产生各种酶来降解除草剂，称为酶促反应针对黑龙江省大豆田长期施用的主要除草剂对后茬作物造成的药害问题，本课题组在长期使用氟磺胺草醚的
9、土壤中筛选出高效降解菌株 Shigella flexneri FB5 ，其降解率可达到 88.32% 。为明确该菌株降解氟磺胺草醚的相关机理，本研究利用双向电泳技术发现菌株在氟磺胺草醚诱导下产生得到差异蛋白点，经过气质联用仪进行蛋白质鉴定得到氨基酸序列，经数据库检索得到差异蛋白的功能，根据氨基酸序列设计引物，为氟磺胺草醚的生物修复提供了良好的微生物资源。2. 材料与方法2.1 材料菌株：来自实验室筛选鉴定的降解菌，培育驯化的降解氟磺胺草醚的菌株Shigella flexneriFB5。培养基：基础无机盐培养基 (MSM ， g) ； LB 培养基 (g/L) ； 3/10 LB 培养基。主要试
10、剂：氟磺胺草醚（虎威）25% 水剂（大连松辽化工有限公司） ；氟磺胺草醚标准品 （分析标样， AccuStandard ）；二氯甲烷（富宇试剂，天津市富宇精细化工有限公司） ；甲醇（色谱纯，山东禹王）；氯化钠 （分析纯， 天津市鼎盛鑫化工有限公司） ；硫酸钠（分析纯， 天津市致远化工试剂有限公司） ；琼脂糖（ Unit A,8/F,Shell Industrial Building,12 Lee Chung Street,Chai Wan, Hong Kong ）； TAE 缓冲液（苏州泽科生物技术有限公司）；双向电泳试剂：三氯乙酸（上海生工)， -巯基乙醇（上海生工），丙酮（分析纯，天津光复
11、科技公司），蛋白酶抑制剂（ Calbiochem ），尿素（上海生工） ，硫脲（上海生工），3-(3- 胆酰胺丙基 )-二乙胺 - 丙磺酸 （GE ），二硫苏糖醇（ GE ），两性载体pH:3-10（ GE ），2D-quant蛋白质定量试剂盒（GE ）， IPGBufferpH4-7 （ GE），碘代乙酰铵 （ GE ），矿物油（ GE），丙烯酰胺（上海生工） ，甲叉双丙烯酰胺 （上海生工） ，四甲基乙二胺 （上海生工） ，过硫酸铵 （上海生工） ， Tris 碱（上海生工） ，丙三醇（天津光复科技公司分析纯），十二烷基磺酸钠 （ GE），溴酚蓝（上海生工） ，正丁醇（分析纯，天津光复科技公
12、司）， HCl （分析纯，天津光复科技公司） ，考马斯亮蓝 R-250（ GE），乙醇（分析纯，天津光复科技公司） ，冰醋酸（分析纯，天津光复科技公司） ，低熔点琼脂糖 （上海生工） ，甲醇（分析纯， 天津光复科技公司） ，磷酸氢二钠 （分析纯，天津光复科技公司） ，硫酸镁（分析纯，天津光复科技公司） ，磷酸二氢钠 （分析纯， 天津光复科技公司），磷酸（分析纯，天津光复科技公司） ，牛血清白蛋白（天为时代） ，低分子量蛋白 （天为时代） ，聚乙烯吡咯烷酮（上海生工） ，甘氨酸（ GE），碳酸氢铵（分析纯， 天津光复科技公司） ，乙腈（分析纯，天津光复科技公司） ，三氟乙酸（ GE ），胰蛋白酶
13、（ GE ）， Tris 饱和酚 pH8.8 （上海生工） 。主要仪器：高速冷冻离心机（CF16RXII ，日本日立）；振荡混合机（ VORTEX-5 ，海门市其林贝尔仪器制造有限公司） ；电子分析天平 （ AB104-N ，梅特勒-托利多仪器有限公司）；超净工作台（ DL-CJ-2N ，北京东联哈尔仪器制造有限公司） ；移液器（ BG-easy PIPET ，北京百晶生物技术有限公司）；超声波清洗仪（ HS3120 ， HENGAO T&D ）；冰箱（ BCD-216FTB ，青岛海尔股份有限公司） ；制冰机（ F125C，意大利 Castel MAC SpA ）； 双向电泳仪（ Ettan
14、 2DE ，美国通用电气公司） ；电热恒温鼓风干燥箱 （ DHG-9140 ，上海精宏实验设备有限公司）；紫外可见分光光度计（ TU-1810 ，北京普析通用仪器有限责任公司） ；电热恒温水浴锅 （ HH S11，上海跃进医疗器械厂）；凝胶成像系统 （ AlphaImagerHP ， Alpha Innotech Corp. ）； PCR 仪（ TPSG，德国Biometra GmbH i.L）。2.2降解菌的富集驯化和总蛋白提取参考药瓶富集培养法， 对降解菌进行富集驯化，得到最终浓度为 500mg/L 的降解菌溶液。将降解菌以 1% 的接种量接入到 500mL 的 LB 培养基中在37 恒温摇床上180r/min 进行扩培，得到降解菌溶液。将培养后的降解菌溶液以1%的接种量接种到21L 的发酵罐中培养12h，得到降解菌培养液，测定 OD 值。配制 6 瓶 100mL 3/10 LB 培养基，其中三瓶分别加入25% 的氟磺胺草醚200 L；在 6 瓶中分别加入对数生长期OD值为1.00 的 FB5 菌株1mL ；每隔一小时每瓶取3mL 菌液，测定 OD 值。培养细胞的收集：用20mM Tri-Cl ，pH7.5 ，250mM甘露醇洗细胞3 次，离心（室温，1000g ， 2min ）；分装细胞于1.
