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1、热休克蛋白27在人胸主动脉夹层的表达研究 作者：廖明芳崔佳森张健王亮刘延玲包俊敏景在平【摘要】 目的：探讨热休克蛋白（heat shock protein, HSP）27在胸主动脉夹层（thoracic aortic dissection,TAD）中的表达情况，并初步了解其在TAD中的可能作用。方法：组织化学染色检测TAD病理特征，免疫组织化学染色检测HSP27在动脉壁中的表达和定位， Western Blot验证其表达，并分析HSP27表达与TAD患者临床病理参数如直径、高血压和炎症反应等的关系。结果：Western blot和免疫组化染色均显示HSP27在两组标本中均有表达，TAD组表达较
2、正常组减低。HSP27蛋白主要位于中膜和外膜小血管和炎性细胞的胞质。相邻切片肌动蛋白表达分布与HSP27基本一致。HSP27表达与其直径、患者高血压、急慢性病程和年龄等参数无明显相关性，这可能与例数较少有关。结论：HSP27蛋白在TAD中表达减少，中膜平滑肌细胞（smooth muscle cell, SMC）是其主要细胞来源；HSP27可能通过调节肌动蛋白和SMC的功能等机制在TAD发挥作用，需进一步研究证实。 【关键词】 胸主动脉夹层热休克蛋白血管平滑肌细胞 Expression of heat shock protein 27 in human thoracic aortic disse
3、ction 【ABSTRACT】 Objective: To find HSP27 potein expression changed in thoracic aortic dissection （TAD） compared with normal control by differential proteomics approach. This study was performed to investigate the expression and localization of HSP27 and its possible roles in TAD. Methods: Histology
4、 and immunohistochemistry were performed to detect the expression and localization of HSP27 protein in dissected thoracic aortas and normal controls. Western Blot was used to invalidate its expression. Then the correlation between HSP27 expression and some clinical parameters such as diameter and hy
5、pertension were analyzed. Results: Western blot and immunohistochemistry showed that HSP27 expression decreased in TAD compared with normal controls. HSP27 protein mainly localized in the media. Contiguous slices of TAD showed similar expression and distribution between alpha actin and HSP27. There
6、was no significant correlation between HSP27 protein expression and clinical parameters including ages, diameters, hypertension and inflammation, which might be related to the small sample size. Conclusions: HSP27 protein expression decreased in TAD and SMC was the main cellular resource. HSP27 may
7、play important role in TAD through some mechanisms such as regulating SMC and actin function, which need further research. 【KEY WORDS】 Thoracic aortic dissectionHeat shock proteinsVascular smooth muscle cells 主动脉夹层（aortic dissection, AD）是累及主动脉最灾难性的疾病，主要发生在胸主动脉，称胸主动脉夹层（thoracic aortic dissection, TAD
8、）。近年TAD的发病率呈上升趋势，发病年龄趋向年轻化，TAD一旦破裂死亡率极高，是严重危害中老年患者生命的主要心血管疾病之一1。随着腔内血管外科理论和技术的发展，TAD的治疗已经取得了较大的进展，部分TAD患者已从传统的开放性开胸人工血管置换术转向微创的腔内隔绝术2，降低了病死率及各种手术并发症率。尽管这些方法能较有效的治疗TAD，仍有许多患者在明确诊断前或得到手术治疗之前已经破裂死亡，尤其是急性主动脉夹层破裂，是猝死的重要原因之一，。因而，从发病机制水平进行TAD的预防、诊断和治疗的研究具有非常重要的意义，而目前对TAD发病机制的认识仍处于初步阶段。本研究前期研究应用差异蛋白质组学方法对TA
9、D夹层撕开动脉和正常人胸主动脉壁中膜的蛋白质组进行比较分析,发现两组动脉壁组织中的热休克蛋白（heat shock protein, HSP）27表达存在差异。本研究在差异蛋白质组学研究的基础上进一步验证HSP27在TAD中的表达与定位，并初步分析其在TAD中的可能作用。 1材料与方法 1.1标本采集实验标本为 TAD 患者的夹层撕开动脉壁（dissected aorta, DA）和正常人胸主动脉壁（normal aorta, NA）。收集我院 20032005 年行人工血管置换术的TAD患者 6 例，获取新鲜胸主动脉夹层标本。患者均为男性，中位年龄48.1岁，均诊断为急性Debakey型夹层
10、，MRA或CTA显示升主动脉平均最大直径为（5.621.3）cm，其中合并高血压者 5 例（83.3%），无马凡综合征等先天性疾病。大体标本观察动脉环明显扩张，约 1/22/3 的动脉环可见夹层撕裂，假腔内可见血栓，其中 5 例标本的内壁可见程度不等的米黄色粥样硬化斑块。从器官移植供者中获取正常新鲜升主动脉 6 例，均为男性，平均年龄（39.57.2）岁，动脉平均直径（2.480.3） cm，均无主动脉夹层和动脉瘤等血管疾病史。大体观察动脉环呈圆形，弹性较好，动脉壁完整，其中有2例可见轻中度的粥样硬化斑块。 人TAD动脉壁石蜡包埋标本15例（包括上述6例异常标本，其余9例来源于主动脉切除人工血
11、管置换术的TAD患者），男13例，女2例，中位年龄45.5岁。正常对照为正常人胸主动脉石蜡标本10例（包括上述6例正常标本，其余4例来源于尸检和器官捐献者），男8例，女2例，中位年龄38.3岁，除上述2例外均无主动脉疾病。 1.2标本处理获取新鲜标本后，用预冷的生理盐水冲洗数遍，洗净附在血管壁上的血液和附壁血栓，按实验分组剪取所需标本浸入4%甲醛保存，其余标本分装后做好标记立即置于液氮中保存备用。 1.3苏木精伊红染色（HE 染色）和维多利亚兰染色（VB 染色）4 甲醛固定、脱水、组织浸蜡、包埋，连续切片 5 m 厚。染色按常规操作进行。 1.4免疫组织化学染色对同一标本的相邻切片分别进行各指
12、标的免疫组化染色（室温下完成），采用二步法免疫组织化学检测试剂盒（GBI, USA），基本流程按常规操作。一抗为抗人HSP27单克隆抗体和兔抗人肌动蛋白抗体，按1100稀释，DAB显色。实验对照设立：1）空白对照：用PBS代替一抗作阴性对照，结果为阴性。2）替代对照：用正常未免疫血清代替一抗作阴性对照，结果为阴性。3）用已阳性组织作阳性对照，结果为阳性。应用Leica显微镜及Qwin 550图像采集卡进行图像采集，镜下阳性蛋白为黄色、棕黄色或棕色颗粒样沉淀。按以下标准进行判断统计，在400倍显微镜下随机取10个视野，计算阳性蛋白百分比（阳性细胞数占细胞总数的百分比），然后进行综合评分（由两人分
13、别进行判断统计）。两分相加：0 分为阴性（-），23 分为弱阳性（+），45 分为中度阳性（+），67 分为强阳性（+）。-SMA 染色及结果和炎症反应程度的判断同 HSP27。 1.5Western 印迹法每个样品等量上样于12聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳，然后转膜、抗体结合及染色。按常规操作进行。 1.6统计学分析用SPSS10.0软件进行分析，HSP27 的染色强度与病例的临床参数如直径、年龄和高血压等参数应用 Cochran-Mantel-Haenszel（CMH）2 进行统计学分析。 2结果 2.1组织化学染色HE和VB染色结果显示正常人胸主动脉管壁结构完整，内膜完整，管壁平滑肌细胞（
14、smooth muscle cells, SMCs）数量较多（图1 A），VB下可见完整内弹力膜，弹力纤维呈蓝色，位于中膜排列整齐，未见弹力纤维断裂，胶原纤维呈红色，在中膜及外膜均有显色，主要位于外膜（图1 B）。TAD动脉壁HE染色可见明显夹层，夹层中可见血栓或血液，SMC变性、肿胀，纤维组织增生、胶原化，部分区域黏液样变性，外膜血管增生，外膜及夹层撕开周围区域可见程度不等的淋巴细胞、中性细胞和浆细胞浸润，部分动脉壁可见较多空泡细胞、胆固醇结晶等（图1 C）。TAD动脉壁VB染色可见平滑肌弹力纤维断裂，减少甚至部分消失，外膜胶原纤维增生（图1 D）。 2.2HSP27 蛋白的免疫组织化学染色
15、免疫组织化学结果显示 HSP27 在 NA 和 DA 中均有表达（图2），而Western Blot显示TAD组的HSP27表达较NA组减低（图3）。HSP27 表达位于胞质，主要定位于中膜和外膜小血管。同一组织相邻切片的SMA染色显示与 HSP27 表达分布相一致，提示主要由 SMC 表达。TAD 的 HSP27 表达除中膜和外膜血管外，炎性细胞区域亦有表达。另外可见 TAD 中外膜交界处夹层撕开层面两边有一条带，为HSP27阴性染色区，该条带内的细胞核及肌动蛋白染色亦明显减少。 2.3Western blot 结果显示NA 组的 HSP27 表达高于DA组（P<0.05），见图 3
16、。 2.4HSP27 表达与临床指标相关性分析将 15 例 TAD 动脉壁的 HSP27 染色强度与各项临床病理等参数进行相关分析，CMH 2 检验，结果显示HSP 染色强度与动脉壁炎症反应程度、动脉直径、年龄、急或慢性病程、高血压及马凡综合征无明显相关（P均0.05，表1）。将炎症反应程度与急慢性病程及高血压进行相关分析（表2），显示 DA 中炎症反应程度与急慢性病程相关（P<0.05），而与高血压不相关（P>0.05）。 3讨论 TAD 指主动脉腔内血液通过主动脉壁上的内膜撕裂口进入主动脉中膜外层或中外膜交界处，使主动脉壁裂开为两层，夹层可沿主动脉纵轴延伸，形成动脉瘤，甚至破裂。其发病机理可简单概括为动脉壁本身病变和血液动力学两大因素共同作用，本研究主
