实验一-DNA提取

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1、实验一 -DNA提取实验一 DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA （CTAB法）1实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高 分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组 southern分析、酶切及克隆等， 这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定 DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法，进一步了解DNA的性质。2实验原理细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。 提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质， 最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DN

2、P与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度 的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例： RNP在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1%。 当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。 当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通 常可用1.4mol/L NaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处 理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。关于植物总DNA的提取主要有两种方法：1. CTAB 法：CTAB （十六烷基三甲基溴化铵，hex

3、adecyltrimethylammonium bromide,简称 CTAB ）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶 液中（0.7mol/LNaCI ）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度 （0.3 mol/L NaCl ） 时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开， 然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀， CTAB能溶解于乙醇中。2. SDS 法:利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate,简 称SDS）使DNA与蛋白质分离，在高温（5565

4、C）条件下裂解细胞，使染色体 离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及 多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组 DNA为107109bp,在基因克隆工 作中，通常要求制备的大分子 DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会 由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克 隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖 等杂质，并防止和抑制内源DNase对D

5、NA的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA的 机械剪切破坏。几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白 质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如 EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA处于溶解状态 时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行 DNA溶液转移时用大口（或 剪口）吸管。提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外 吸收、化学测定、熔点”（melting temperature, Tm ）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定

6、。3材料和试剂：3.1长春花叶片3.2试剂（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）,20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCI （如表1），2% CTAB，使用前加入0.1% （ V/V ）的&巯基乙醇。 表1 CTAB提取缓冲液配制M.W.配制1 OOOmL削制500mLTnsm 14P 11426.057gEDTA-372.247.-H48e3.7224SE 44Sl.SltSe44)90 軀用HCI调pH值。（2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA （ pH8.0）（3）氯仿/异戊醇：将氯仿和异

7、戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4C保存。 4仪器设备离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、 冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。5方法与步骤：5.1在提取过程中用到的吸头，提取缓冲液等先高压灭菌（121C，20min），取出后待用；5.2取大约指甲盖大小的植物叶片，放入1.5ml的EP管中,加入液氮，用钢珠研 磨成粉末状，再加入600此的CTAB提取缓冲液，；5.3 65C水浴锅中水浴40min，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻轻混匀， 颠倒几次，乳化1min。4C， 11,000rpm离心10min ；5.4吸上清到新离心管中（

8、约400卩l ），加入等体积预冷异丙醇，混匀，-20C放 置20min沉淀DNA ;5.5 5000 rpm常温离心15min，倒掉上清液；5.6用75%乙醇（900卩I）洗沉淀，11,000rpm离心2min，倒掉乙醇，再用乙醇 同样处理一次；5.7置于干燥仪干燥10min，将水分蒸干；5.8加入50丄去离子水，融解 DNA，同时加入RNA酶（按每50丄DNA加入1此 RNase）， 37C 30min ；5.9利用分光光度计检测OD260,同时进行1 %凝胶电泳检测；5.10琼脂糖电泳检测DNA :制作1%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液5此 电泳检测；5.11 -20C保存DNA备用；

9、5.12提取的DNA的浓度检测：取少量待测DNA样品，用蒸馏水稀释1,000咅； 用蒸馏水做空白，分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值。【注意事项】1. 叶片磨得越细越好。2. 注意移液器的正确使用。3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活 性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出 DNA酶，使 DNA降解。6.思考题1 制备的DNA在什么溶液中较稳定？2为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、 抽提过程中应注意什么？7实验结果：结果计算DNA浓度 =一-怖释倍数 0.02Q L 式中OD260nm 为260nm 处的光密

10、度；L为比色 杯光径（cm）; 0.020为1卩g/mL DNA钠盐的光密 度。DNA的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为 230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述 DNA溶液适当稀释后，在751分光光度计上测定 其 OD260nm、OD230nm 和 OD280nm。如OD260nm/OD230nnr 2OD260nm/OD280nrr 1.8,表示RNA已经除净，蛋白含量不 超过0.3%。8实验分析:传统DNA提取方法CTAB法、SDS法是在裂解细胞的基础上，多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质 变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的；加入RNA酶除去核酸 中的

11、RNA;然后加入异丙醇、乙醇等沉淀 DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀，除去分离过 程中残留的有机溶剂和盐离子，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应最后用TE溶解DNA备用。CTAB是一种阳离子去污剂，能与核酸形成复合物，此复合物在高盐 （ 0. 7 mol/L）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0. 10. 5 mol/L NaCI）下 CTAB -核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶 液中。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸 分离出来。经离心弃上清后,CTAB -核酸复合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB。SDS是一种

12、阴离子去垢剂，在高温（5565 C）条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋 白变性,同时SDS与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸；提高盐（KAc或NH4AC）浓度并降低温度（冰浴），使SDS -蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形 式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全 ，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯 仿抽提仮复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA o SDS法操作简单，温和，也可提取到 高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品 提取的DNA纯度能够满足 一般分子生物学的需要，一直作为DNA提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂 耗

13、时长，易交叉污染，残留在DNA溶液中有机物质对DNA聚合酶有抑制作用。另外, 酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者健康。DNA提取新方法近年来出现了以螯合树脂、特异性DNA吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础DNA提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物 细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品DNA。已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA的报道。马小军等将CTAB液 提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过Wizard纯化系统纯化得到的 DNA ,RAPD扩增效果良好，产率达2 250卩gg。张博等用硅珠（SiO2）颗粒吸附DNA纯化方法，从不同树木

14、叶片中均得到了高质量 的DNA样品。黄椰林等对常规CTAB法提取的DNA用玻璃粉悬浮液纯化，所获DN的APCR产物 能直接测序，比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物 样品和长期保存的标本材料。袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA。目前国内外开发了多种商品化的 DNA提取纯化试剂盒，其分离原理有的利用核酸的 分子量差异，有的利用特异性膜与DNA结合达到分离、回收的目的，如离子交换柱、 磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法，操作简单、高效,DNA质量较高，但价格昂贵，提取量少。著名的国外的试剂盒生产厂家有 Sigma2Ald

15、rich、Promega、Invitrogen、TaKaRa、Whatman等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、 加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。国内的生物公司发展迅速，如上海生工、北京天为、北京博奥等也开发了系列试剂盒， 质量与国外厂家相当，价格较低。除此之外，由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低，还有大量的生物公司提供试剂盒产 品，使用者一定要慎重选择。DNA试剂盒经过了几十年的发展，已经不再局限于单纯的提取纯化，有些厂家推出了 DNA提取一扩增PCR试剂盒，将DNA提取和PCR扩增结合起来，极大的提高了工 作效率，如 Sigma2Aldrich 公司的 SigmaSxtract2N2Amp Plant PCR kit 等。另外,还有高通量的 DNA提取产品，如高通量组织细胞研磨仪 MM301 ,在常温和冷 冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎，每次处理样品的个数 可以多达48个甚至192个。美国应用生物系统公司6100型核酸提取仪，可用于RNA、DNA的提取纯化,可自编程序,可选预设的程序，具有严格的防交叉污染体系, 可从不同来源的样品中同时提取 96个样品。