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1、 毕 业 论 文题 目： 饲用植酸酶及酶学性质研究 系 部： 生物工程系 专 业： 食品生物技术 班 级： 食品生物0831 姓 名： 学 号： 指导教师： 2011年 月 日 毕业设计（论文）任务书班 级食品生物 学生姓名 指导教师 设计（论文）题目饲用植酸酶及酶活性质研究主要研究内容本次研究的主要内容是饲用植酸酶的来源分类，作用机理，酶活性质影响因素及其测定方法。主要技术指标或研究目标1植酸酶的来源及其分类2植酸酶作用机理的研究3植酸酶活性的测定方法4影响植酸酶活因素的研究基本要求1. 掌握实验仪器的使用要求和方法2. 对于此次研究应具有严谨的态度，认真记录数据，认真分析数据主要参考资料及
2、文献1 褚西宁.变灰青酶固态发酵降解植酸酶的初步研究J.微生物学通报, 2006, 23(4): 217-220.2 陈寅.大肠杆菌植酸酶基因appA的克隆与高效表达 J.微生物学通报, 2004, 31(3): 74-78.3 蒋治国，王士长，何飞燕.植酸酶的研究进展及其在饲料中的应用J.广西农学报，2005，（4）：20-26.4 胡春霞,宋会仪.提高真菌植酸酶热稳定性的方法J.饲料广角,2006(6):33- 34.5 刘志伟,黄玉亭,张铁鹰,等.国标法测定植酸酶活性存在问题的探讨J.中国饲料,2006(18):2931 目录摘要11 前言21.1 饲用植酸酶21.2 饲用植酸酶的来源2
3、1.3 饲用植酸酶的分布31.4 饲用植酸酶的分类31.4.1 根据植酸酶的来源分类31.4.2 根据植酸酶的作用方式分类31.4.3 根据植酸酶的基因及氨基酸序列不同分类31.4.4 根据植酸酶的加工工艺分类41.5 饲用植酸酶的作用机理41.6 影响饲用植酸酶作用效果的因素41.6.1 pH51.6.2 温度51.6.3 湿度51.6.4 饲料中钙、磷及钙磷比例61.6.5 VD361.6.6 有机酸61.6.7 植酸酶添加水平71.6.8 其它因素72 材料方法72.1 植酸酶活性单位定义72.2 实验原理72.3 材料与试剂72.4 饲用植酸酶活性测定方法82.5 酶活测定步骤82.5
4、.1 样品溶液的制备（即稀释）82.5.2 反应92.5.3 样品测定92.5.4 计算公式92.6 饲用植酸酶酶学性质102.6.1 酶反应的最适pH102.6.2 酶反应的最适温度102.6.3 酶的耐热性103 结果与分析103.1 饲用植酸酶的最适反应pH103.2 饲用植酸酶的最适反应温度113.3饲用植酸酶的耐热性124 讨论124.1pH值对饲用植酸酶活性影响124.2温度对饲用植酸酶活性影响134.3饲用植酸酶的热稳定性135 结论135.1 pH值对饲用植酸酶活性影响135.2 温度对饲用植酸酶活性影响135.3 饲用植酸酶的热稳定性13参考文献15致 谢17摘要 本文以饲料
5、级植酸酶为对象,研究了pH、温度以及热处理对其活性的影响。实验显示:该植酸酶在pH4.5-6的范围内均有80%以上的酶活性,最适pH为5.5;在温度30-50之间具有5000 U/g以上的酶活性,最适温度为40;在80热处理20 min可保持90%以上的酶活,在90热处理20 min仅剩51.04%酶活。结果表明: pH、温度、热处理对植酸酶均有一定影响,饲料中添加植酸酶应该考虑这些因素。采用钒钼酸铵法对植酸酶的酶学性质进行研究表明:该酶有较强的耐酸性,具有很强的耐热性,干热处理对酶活没有影响;经湿热试验箱90 95%RH处理10min,酶活能保存约60 %。关键词：植酸酶；酶活性；PH；耐热
6、性1 前言酶是活性细胞所产生的具有高度催化效能和催化特异性的生物大分子,在生物体内消化与新陈代谢过程中起着非常重要的作用。饲用植酸酶是由微生物如细菌、酵母和真菌通过发酵生产的生物制品，是催化植酸及植酸盐水解为肌醇与磷酸（磷酸盐）的一类酶的总称。植酸及其盐类普遍存在于植物体中，是植物种子及营养器官中磷的主要贮存方式，一般植酸磷占禾谷种子及油料作物总磷的60%-80%。在人和单胃动物食物中，植酸具有强烈的抗营养作用（褚西宁，2006）。这是由于一方面人和单胃动物缺乏分解植酸的酶类，无法利用植酸中的磷，另一方面植酸能与矿质元素如铁、锌、钙和镁等蛋白质形成不溶性的稳定的复合物，降低了矿质元素和蛋白质的
7、利用率。植酸酶作为一种新型的饲料添加剂，能分解饲料中的植酸，形成禽畜可利用的磷酸，提高饲料中有机磷的利用率，减少添加无机磷，降低饲料成本，减轻磷污染，同时解除植酸的抗营养作用，提高饲料的营养价值，具有非常可观的经济效益和生态效益。目前为止，许多学者对多种微生物植酸酶进行研究，结果表明，不同来源植酸酶的性质具有较大差异。植酸酶在粉状饲料中已大面积推广使用,但在制粒料中,由于制粒高温对酶活的影响,制约了植酸酶的使用。颗粒饲料中使用植酸酶的途径,一是通过液体后涂;二是添加耐热植酸酶。试验以饲用植酸酶为研究对象,研究其最适反应温度、最适反应pH、耐热性，为耐热植酸酶的应用和生产提供基础支持。1.1 饲
8、用植酸酶近些年来，饲用植酸酶在实际应用中显示出了巨大的优势。植酸酶（phytase），其系统名称为肌醇六磷酸酶（myoinositol hexaphosphate phosphohydrolase），属于磷酸单酯水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸（磷酸盐）的酶类总称。在饲料中用植酸酶代替磷酸氢钙后，它可以通过催化水解反应降解饲料中的植酸盐，生成无机磷和肌醇以及与植酸结合的矿物元素、蛋白质、氨基酸等，提高了其生物利用率，降低了植酸的抗营养效应，而且对动物具有良好的增重效果，同时还降低了动物机体磷的排泄量，保护了生态环境，所以是一种新型饲用酶制剂（陈寅，2004）。1.2 饲用植酸酶的来源
9、植酸酶有3种来源：微生物、植物和动物。1.3 饲用植酸酶的分布许多作物籽实及其加工副产物中含有天然植酸酶，如小麦（wheat）、玉米（maize）、大麦（barley）、黑麦（rye）、小黑麦（triticale）、燕麦（oat）、水稻（paddy）、豆类（beans）等籽实中植酸酶已被分离并鉴定。不同作物、不同品种植酸酶的含量（活性）差异很大，而且在籽实中的分布也不同。玉米、高粱、油菜籽中的植酸酶活性很低，而小麦、黑麦、小黑麦和一些蒸馏副产物如玉米蒸馏物均含有很高的植酸酶活性。小麦、黑麦和小黑麦中植酸酶大部分在糠麸（籽实包皮）中。在种子休眠期，植酸盐和植酸酶是分开的，但在萌发或加工及动物消化
10、时酶和植酸盐底物相互接触，使得植酸盐被分解（蒋治国，2005）。1.4 饲用植酸酶的分类1.4.1 根据植酸酶的来源分类根据植酸酶的来源不同可分为微生物植酸酶、植物性植酸酶和动物性植酸酶。1.4.2 根据植酸酶的作用方式分类根据植酸酶对植酸的作用方式可分为3种类型：（1）3-植酸酶（3-phytase，E.C.3.1.3.8），其系统名称为肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶。3-植酸酶作用于植酸时，首先从肌醇的第3碳位点上开始水解酯键释放出无机磷酸盐，然后再依次释放其它碳位点的磷酸盐，最终将整个六磷酸肌醇依次水解为五、四、三、二、一-磷酸肌醇及正磷酸。这种植酸酶存在于植物、霉菌、酵母和细菌中，其酶作用
11、在酸性pH值范围内存在高峰，与胃中底物环境相适应，此类酶须在二价金属离子（Mg2+）参与催化才能发挥作用；（2）6-植酸酶（6-phytase，E.C.3.1.3.26），其系统名称为肌醇6-磷酸水解酶。6-植酸酶作用于植酸时，首先从肌醇的第6碳位点上开始水解酯键释放出无机磷酸盐，然后再依次释放其它碳位点的磷酸盐，最终产物都是单磷酸肌醇（2-磷酸肌醇）和正磷酸。这种植酸酶存在于植物籽实中，在干燥状态和休眠状态下没有活性，只有在种子发芽时才被激活，其酶作用的最佳pH值范围是5.07.5，不适合在饲料中应用。（3）非特性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶，首先催化植酸第2位上的磷酸水解释放无机磷酸盐，然后再
12、依次释放其它碳位点的磷酸盐。1.4.3 根据植酸酶的基因及氨基酸序列不同分类不同物种、甚至同一物种不同生存环境来源的植酸酶其核酸序列、氨基酸顺序、底物特异性、最适pH、最适温度、分子量大小等理化、酶学性质均有程度不同的差别。根据基因及氨基酸序列比较，结合酶学性质研究，目前将植酸酶大致分为5类：霉菌及部分细菌来源的PhyA与PhyB、Bacillussubtilis来源的PhyC、玉米植酸酶、其它类植酸酶。霉菌来源（主要指曲霉）的植酸酶主要分为两类：3-植酸酶PhyA与6-植酸酶PhyB（罗会颖，2006）。1.4.4 根据植酸酶的加工工艺分类根据加工工艺不同可将植酸酶分为粉状、液体状和颗粒状植
13、酸酶。粉状植酸酶制造成本低，具有容易混合的特点，适宜于生产对植酸酶效价破坏小的饲料产品，在高温、高湿环境中易失活；液体状植酸酶在饲料中添加量极小，对喷涂精度要求高，在饲料工业中使用较少；颗粒状植酸酶经过保护，热稳定性高，储存期长，在动物体内释放速度快，流动性好，但是价格较高。1.5 饲用植酸酶的作用机理植酸的代谢机理研究始于20世纪60年代，但直到目前对于植酸的代谢过程和形成的产物仍然是植酸酶研究的一个热点问题。植酸酶水解植酸是分步进行的，它将植酸分子上的磷酸基团逐个切下，形成中间产物IP5，IP4，IP3，IP2，IP，终产物为分子量为351的肌醇二磷酸脂与一些无机磷分子。这些无机磷分子还能
14、与未水解的植酸以“-O-O-”或“-O-”键形成肌醇多磷酸脂这样更复杂的分子。在理论上，植酸酶只能将植酸分解为肌醇磷酸酯，不能彻底分解为肌醇和磷酸，只有在酸性磷酸酶的帮助下，才能将单磷酸酯、二磷酸酯彻底分解成肌醇和磷酸。不同来源植酸酶作用机理有所不同，大多数微生物来源的植酸酶的作用机理如下：植酸D-1,2,4,5,6-五磷酸肌醇D-1,2,3,4,5-五磷酸肌醇1,2,5,6-四磷酸肌醇1,2,5-三磷酸肌醇或1,2,6-三磷酸肌醇1,2-二磷酸肌醇2-磷酸肌醇（王国坤，2006）。从植酸水解到2-磷酸肌醇，再水解成单磷酸肌醇时，酶活力已很低了，无法分解单磷酸肌醇，因此，如要将其彻底水解为肌醇和无机磷酸，只有酸性磷酸酶的帮助才能完成。理论上讲，1个植酸分子被完全水解时可释放出6个磷离子，即1g植酸分子能释放出281 mg的磷。1.6 影响饲用植酸酶作用效果的因素1.6.1 pH植酸酶作为酶的一种，符合酶学的普遍规律，需要有相应的pH值、温度、湿度等条件，只有在适宜的环境条件下才能表现出高活性。在其他条件不变时，酶在一定的pH范围内活性最高，此pH值称为酶作用的最佳pH。植酸酶的最适pH值为2.0-6.0。根据来源不同差异
