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1、铜绿假单胞菌整合子和多重耐药性研究 摘要 目标 在铜绿假单胞菌中检测1类整合子并分析整合子对细菌耐药性的影响。 方法 用VITEKAMS 微生物自动分析仪判定细菌和药敏试验，用PCR方法扩增I类整合酶基因，经电泳后检测扩增产物。 结果 158株铜绿假单胞菌中检测出1类整合子42株，检出率为26.6%。1类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药品表现出较高的耐药率。携带1类整合子菌株易表现出对最少4种抗菌素的多重耐药性，其多重耐药率为68.6%(33/48)，显著高于1类整合子阴性菌株（28.6%），P0.05。 结论 1类整合子广泛存在铜绿假单胞菌中,1类整合子对细菌多重耐药性的产生
2、和传输起着主要作用，应加强临床细菌基因水平的耐药监测，采取有效方法预防耐药性的传输。关键词 铜绿假单胞菌 整合子 多重耐药Abstract Objective To study distribution of the integron in Pseudomonas aeruginosa and evaluate the class 1 integrons to the antibiotic resistance. Methods MICs of 11 different antimicrobial agents against 158 isolates of Pseudomonas aerug
3、inosa were determined by VITEK GNS card.The presence of class 1 integrase gene was determined by Polymerase Chain Response (PCR) with integrase specific primer and examined by electrophoresis. Results 42 strains(26.6%)of 158 Pseudomonas aeruginosa were observed in class 1 integron. Similarly on the
4、basis of 8 antibiotics in the group with class 1 integron was higher than that in nonegroup (P0.05). All the integronpositive strains were resistance to at least 4 antibiotics. In the group with class 1 integron the multidrugs resistance rate was 68.6%,but in the nonegroup was 28.6%,the difference o
5、f the rates between two groups was significant(P0.05).Resistant rate of integronpositive strains to aminoglocosides, fluroquinolone and cephalosporins was higher. Conclusion Our study suggests that integron existin in Pseudomonas aeruginosa widely. The antibiotics resistance of the integron positive
6、 strains was than higher that of the negative ones.Key WordsPseudomonas aeruginosa integron multidrug resistance铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院内感染的关键病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者和术后或一些诊疗后的患者易感染本菌。本菌引发的感染病灶可造成血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。伴随抗生素的广泛使用和不合理使用，使包含铜绿假单胞菌在内的多个细菌的耐药性问题日益严重。整合子是和细菌耐药性传输相关的基因系统，整合子经过捕捉和整合细菌耐
7、药基因，在细菌耐药性的传输和扩散中起了主要的作用。整合子经过位点特异性的基因重组可整合多个耐药基因对细菌多重耐药的形成起着主要作用职称论文。本文对158株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子和其多重耐药性之间的关系。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株2021年10月2021年5月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌158株。标本分别来自老年病房(53株)、呼吸科病房（49株）、普外科病房(28株)、泌尿科病房(16株)和内分泌病房(12株)。菌株分别分离自痰标本（68株）、脓汁(42株)、咽拭子(18株)、尿标本(12株)、伤口分泌物（10株）和血液（8株）。标准质控菌株为铜绿
8、假单胞菌（ATCC27853）。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本试验室分离株经测序证实，作为PCR试验阳性对照。1.1.2 判定卡片全自动微生物分析仪(VITEKAMS)采取的GNI判定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx企业,GNS药敏卡包含氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢她啶、哌拉西林、哌拉西林/她唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺培南11种抗菌药品职称论文。1.1.3 PCR试剂TaqDNA聚合酶,4种dNTP混合液,DNA分子标准参考物购自Takara企业;琼脂糖,溴化乙啶等常见分子生物学试剂购自上海生工企业。1.1.4 关键仪器VITEKAM
9、S自动判定系统购自法国Biomerievx企业;PCR扩增仪、DNA/RNA/protein analyzer分析仪和高速低温离心机购自德国eppendorf企业;PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品;DGW99型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。1.2试验方法1.2.1 菌株判定全部菌株全部用VITEK AMS 分析仪GNI细菌判定卡进行菌种判定。体外药品敏感试验：采取GNS检测卡测定13种抗菌药品对158株铜绿假单胞菌的MIC值，操作方法根据VITEK AMS要求的方法进行。1.2.2加热裂解法制备DNA模板用LuriaBertani液体培养基200r/min振荡培养8h取得对数
10、生长久菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本试验室分离株经测序证实，作为PCR试验阳性对照。1.2.3筛选1型整合子阳性菌株用PCR方法扩增整合子可变区，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可变区下游引物aagcagacttgacctgat，进行PCR扩增。50ulPCR反应体系为:DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反应循环参数设置以下94预变性4分钟；9445秒，55，45秒，723分钟，循环35次；最终72延伸10分钟。1.2.4 PCR反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯
11、下拍照统计结果。1.2.5 统计学处理采取2检验，P0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。2 结果2.1 1类整合子基因检测结果全部158株铜绿假单胞菌的DNA上有42株检测到I类整合子，占细菌总数的26.6%。1类整合子的大小分别为600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。依据各株细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数目，细菌质粒NDA上的整合子可分为5种整合子谱。2.2 1类整合子阳性菌株和耐药性的关系对比1类整合子阳性菌株和阴性菌株对抗菌药品的耐药率，并做统计分析，结果见表1。1类整合子阴性菌株对11种抗菌药品完全敏感率为54.4%（86/158）
12、。1类整合子阳性菌株更易表现出对青霉素、喹诺酮类、磺胺类药品的耐药。耐药率最高的是复方新诺明（100%）其次为氨苄青霉素（90.5%）和庆大霉素（85.7%），丁胺卡那也表现出较高的耐药率（76.7%）。1类整合子阳性菌株对6种药品的耐药率显著高于阴性菌株，P0.05。2.3 1类整合子和多重耐药率的相关性多重耐药率(耐4种以上抗生素)为62.0%(98/158)，其中1类整合子阳性菌株多重耐药率占85.7%(36/42)，阴性菌株多重耐药率为20.7%(24/116)。1类整合子阳性菌株多重耐药率显著高于阴性株，差异有统计学意义(2=18.23，P0.01)。3 讨论整合子是存在于细菌质粒、
13、染色体或转座子上的一个遗传结构，能够捕捉耐药基因，使细菌表现为对抗生素的多重耐药1给临床诊疗带来极大的困难。整合子本身不能移动，但常作为转座子的一部分或借助可移动性质粒在同种细菌或不一样种细菌间播散，造成细菌耐药性的扩大，是细菌多重耐药快速发展的主要原因。依据整合酶的不一样分为6 类2在临床分离的菌株中以 1类合子最为常见。1类整合子基础结构由三部分组成,两端为高度保守的序列，分别称作5CS和3CS,5CS和3CS之间为可变区，可变区由一个或多个外来插入的基因盒组成3。在整合酶的催化下经过位点重组系统整合外来耐药基因，使耐药基因得到不停的累积，从而使细菌含有耐药性和多重耐药性。现在在1类整合子
14、中发觉的基因盒已超出80种，大部分是耐药基因盒，编码产物可给予细菌对几乎全部临床抗生素耐药。铜绿假单胞菌作为医院感染的主要的条件致病菌，在长久应用激素、免疫抑制剂，进行肿瘤化疗、放射诊疗等造成病人免疫功效低下，和手术后或一些诊疗操作后的病人易造成本菌感染，该菌经常含有多重耐药的特点，所以其所造成的感染难以治愈，病死率高。而多年证实整合子介导的多重耐药基因也是造成铜绿假单胞菌多重耐药的关键原因之一4。本研究显示，铜绿假单胞菌在呼吸道的感染占首位为54.5%（86/158），这和大多数文件的报导相符合5究其原因，可能和铜绿假单胞菌轻易定植于呼吸道，且因为气管插管、流感病毒感染及其它多种炎症等原因损
15、害了呼吸道黏膜，在鞭毛或蛋白酶作用下，细菌易于移生、粘附相关。伤口创面也较易受其侵害，检出率32.9%（52/158），居第二位，和其存在广泛及医院环境的隔离消毒程度关系颇大。试验证实，我院患者分离的铜绿假单胞菌对多个抗生素出现高耐药，尤其是表现出对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、单环内酰胺类和磺胺类等的多重耐药性，更是不容忽略。研究表明1型整合子在铜绿假单胞菌耐药性产生的遗传机制上起着主要作用，它是引发细菌多重耐药的主要原因。因为抗生素使用量和种类日趋增多，使细菌生存面临更大的抗生素选择压力。此次研究客观反应了我院铜绿假单胞菌的整合子携带情况，分析此次结果发觉在158株铜绿假单胞菌中检出4
16、2株整合子阳性，检出率为26.6%，和其它报道铜绿假单胞菌整合子检出率不完全相同6，这可能是因为地域的不一样所造成的，也可能和菌株的相关。整合子阳性的细菌表现出多重耐药性比整合子阴性菌高，证实了整合子介导了多重耐药性产生。但因为铜绿假单胞菌耐药机制比较复杂，耐药性还和抗菌药品作用的靶位改变、OprD蛋白缺失引发的菌膜通透性下降、菌体细胞膜上主动外排泵系统的上调和产生B一内酰胺酶等机制相关，对于铜绿假单胞菌的耐药机制还有待于深入研究，以采取有效方法控制其耐药性传输。抗生素的使用越广泛，使携带新耐药基因的优势菌越多，并造成携带耐药基因菌群量更大，为1类整合子多重耐药细菌提供了选择性压力，可能使其耐药种类更多，传输
