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1、For personal use only in study and research; not for commercial use毒死婢当前仍是全球应用最广泛的五种杀虫剂之一，也是我国用量最大的农药品种，是对硫磷、甲胺磷等高毒有机磷农药的替代品种， 主要作为农用杀虫剂 防治水稻、蔬菜等作物的螟虫、韭蛆等近百种害虫，也作为卫生杀虫剂用于防治 白蚁和嶂螂等。美国在20世纪末期毒死婢年用量就已达到约 7000吨，其中3/4 以上被应用于植物保护，其余则用于家庭卫生。毒死婢系列产品（乐斯本乳油） 于1984年在我国农业部农药检定所取得登记，获准在水稻、棉花、蔬菜等作物 上使用；同年，上海市政府在菜
2、篮子工程建设中， 推荐了乐斯本等几种农药用于 防治蔬菜害虫，以彻底取代甲胺磷等高毒农药。虽然毒死婢属于中等毒性杀虫剂，但危险性仍然很大，它能够通过皮肤进入 人体，并且在人体内有累积现象，长期或重复给予亚毒性剂量即可对细胞、 神经 轴突等产生影响，甚至可引起行为改变，WHO规定的毒死婢可接受摄取量为10g/kg/（6,7o随着健康及环保标准的提升，在许多发达国家毒死婢已被禁止使 用，2000年6月8日美国环保署（EPA宣布，禁止在美国家庭和庭院内使用毒 死婢杀虫剂，指出这种常用的杀虫剂会危害到儿童的健康安全。依据美国环保署的意见，新西兰政府决定含有毒死婢的产品自2005年12月31日将不再应用于
3、白蚁的防控，并号召取消毒死婢在所有有可能导致孩子暴露的地方使用，2011年10月28日，新西兰环保署提议禁止毒死婢用于花园。 为了保证儿童健康，几 乎所有的发达国家都已经禁止毒死婢应用于家居, 但是并没有完全禁止其在农业 领域使用；在大多数发展中国家，毒死婢仍是应用最广泛的农用杀虫剂、 由于经 济、技术发展的限制，短期内也不可能完全禁止毒死婢的应用， 那么如何减少应 用毒死婢所导致的负面影响就成为一个亟待解决的课题。1.2毒死婢的微生物降解研究进展微生物的降解作用被认为是环境中有机磷农药残留降解的最主要因素，因此分离筛选能够高效降解有机磷农药的微生物是解决农药污染， 进行环境修复的一 项有效措
4、施8,9。某些有机磷降解菌的降解作用具有广谱性，能降解多种不同的 有机磷农药，这是由于有机磷农药具有相似的化学结构， 降解菌产生的相关酶类作用于有机磷农药的共有结构所致，而降解速度的快慢则可能与农药自身的化学 稳定性、降解酶接触农药靶标位点的难易程度、农药及降解产物对酶促反应的反 馈作用等多种因素有关10,11,有机磷农药初步水解路径如图1-2。筛选能降解多 种有机磷农药的微生物菌株对于农药的污染治理也是一项意义重大的工作，现在也已经分离到了一些这样的菌株12。例如，黄杆菌属细菌Flavobacterium sp.ATCC 27551的水解酶能有效的水解几乎所有已知的O-P键13;缺陷假单胞菌
5、Pseudomonas diminutatfc具有相同降解功能14;近年来也有一些具有类似降解功 能的菌株报道15,16。一般来说，微生物长期持续接触某种农药就可能会诱导出降解该农药的能 力，所以经常从被农药污染的土壤或施用过该农药的土壤中分离针对该农药的降 解菌；也可通过人工措施使微生物适应目标农药，以获取高耐受能力和降解能力的微生物菌株。较早关于毒死婢降解菌的报道是Sethunathan N.等13于1973年从施用二嗪农的土壤中筛选出的黄杆菌( Flavobacterium sp.)以及 Serdar C.M. 等14在1982年筛选出的缺陷假单胞菌(Pseudomonasdiminut
6、a),它们能以共代 谢的方式降解毒死婢，但是不能以毒死婢作为唯一碳源和能源生长。Mallick等17 在1999年报道一株从土壤中筛选出的节杆菌(Arthrobacter sp.)能在无机盐培养基中降解毒死婢，能在 48 h内将10mg/L毒死婢完全降解。Ghanem等18和Li 等19分别分离到了 Klebsiella sp.和Sphingomonassp.,这两个菌株能以毒死婢作 为唯一碳源和磷源。除细菌外，也分离到一些能降解毒死婢的真菌，Bending G.D. 等20 (2002年)筛选出2株能降解毒死婢的真菌Hypholoma fascicularae和Coriolus versic
7、oloro方华2007年从土壤中筛选到一株毒死婢降解菌，经鉴定为 轮枝抱属(Verticillium sp.)真菌。大量的研究表明，在土壤或水体中微生物降解毒死婢的主要中间产物是3,5,6-三氯-2-叱噬酚(3,5,6-trichloro-2-pyridinol,TCP),如图 1-3 21,22。Racke等人 将毒死婢用14C标记后进行微生物降解实验，其结果表明毒死婢经土壤微生物作 用后的初步降解产物为3,5,6-三氯-2-叱噬酚(TCP), TCP能被进一步降解，终产 物为CO223,24。但TCP的进一步降解要缓慢得多，高浓度的TCP对毒死婢的生物降解还有抑制作用，另外，TCP较毒死婢
8、水溶性更大，更容易污染水体和土壤，从而放大毒死婢的危害23。毒死婢的初级降解产物除了 TCP外还有0,0-二乙基 硫代磷酸（盐）（diethylthiophosphate, DETP）,它们均能被微生物完全代谢为无机 物，Singh等人推测毒死婢的微生物降解途径如图1-4,可能会产生约15种中间代谢物2 o毒死婢的微生物降解也与环境因素密切相关，影响到降解菌株生长繁殖的因素都可能会对毒死婢的微生物降解产生影响，例如 ：温度、湿度、pH以及土著微 生物等生物因子。在最近报道的一些研究中都显示毒死婢的最大降解率一般都发 生在中性或者碱性条件下，这可能是由于降解毒死婢的关键酶在中性或碱性条件 下有更
9、大的酶活性，另外，在碱性条件下毒死婢的稳定性会受到影响，其水解率变得更高25。Singh等也报道了应用Enterobactor sp.降解毒死婢，在碱性pH时 实现了毒死婢的快速降解，但在酸性 pH时其速度则很慢26。目前，利用微生物降解毒死婢等农药残留已经成为环境及生物技术领域的研 究热点，在这方面的研究也已经取得了大量成果，分离出了大量降解菌株，并分析研究了相关降解酶及降解基因，但目前所开展的研究工作大多还只是局限在实 验室，进入实践应用的并不多，这主要是由于存在以下问题：筛选获得的农药 降解菌的降解效率普遍较低，而且菌株容易发生变异、退化而丧失降解能力，难 以满足实际需求；降解菌株的应用
10、环境条件不确定， 环境因素波动较大，这在 很大程度上影响到降解菌能否生长繁殖并发挥降解作用；应用到环境中的农药 降解菌会与土著微生物发生相互作用，导致功效的不确定性；将降解菌株制作 成便于储运和应用的制剂是其真正进入实践应用的基础，但目前与之相关的制剂化研究进展缓慢，存在制剂活性低、难于保存、生产成本高等问题。为了做好实 验室研究与实践应用之间的衔接，农药的微生物降解研究应该不仅仅局限在降解 菌的筛选、降解机理、降解动力学等，还应强化以下几个方面：具有农药降解 功能的天然复合菌系的研究与应用；工程菌的构建（拓宽降解谱、提高降解能力），降解酶基因的改造（降解酶的高效表达）等；降解酶及其制剂的研究
11、与 开发；降解菌与降解酶制剂的联合应用；多种降解菌的联合应用。1.3 生防菌及其在防治作物病害中的研究与应用有些微生物对作物病虫害具有抑制或杀灭作用，因此常被用于作物病虫害的 防治，这些有益微生物亦被称为生防菌。按照防治对象的不同，可分为防治作物病原菌的生防菌和防治作物害虫的的生防菌。通常所说的生防菌大多都是用于防 治作物病原菌，其中以防治作物土传病害最为普遍； 而防治作物害虫的生防菌则 多是对害虫有毒害或致病作用的微生物。 生防菌应用上的一项基本要求是不能对 所应用的作物对象有明显负面作用。应用生防菌防治作物病虫害的历史最早是从防治土传病害开始的，在20世纪早期就有人开始研究用微生物防治土传
12、病害，例如，Hartley应用一些常见的腐生真菌和细菌来尝试防治根腐病。在 20世纪30-50年代，技术人员开展了应 用放线菌及其代谢产物防治作物病害的大量研究；而在刚过去的 50年中，生防 菌的研究与应用取得了更快的发展，已有不少成熟的生防菌制剂被应用到农业生 产领域，可应用于作物病害防治的生防菌菌种也越来越多，甚至已经构建了一些 生防工程菌。用作生防菌的菌种主要包括细菌和真菌两个大类，另外也有一些病 毒和噬菌体被当作生防菌使用。近年来，由于人们的生态意识不断增强，长期应用化学农药所导致的环境污 染、农药残留和病原菌抗药性等问题得到了更多关注，以生防菌为代表的生物防治方法成为了近期作物病害防
13、治研究的热点之一。相关研究人员在生防菌筛选、 生防菌菌剂的制备与应用、以及生防菌控病原理等方面开展了广泛的研究， 取得 了大量的成果，主要表现在两个方面，一是生防菌菌种库被不断充实，生防菌制 剂也越来越多，二是对其防病机理的认识不断深入。生防细菌与生防真菌当前，应用较多的生防细菌主要有假单胞菌属(Pseudomonas、芽抱杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、链霉菌属(StreptomyceS等。利用生防细菌 防治作物病害最著名的例子是Kerr利用放射农杆菌(Agrobacterium radiobacterK84)成功防治由致病性农杆菌引起的冠嘤病27,28。
14、近来也有许多性能优异的生防 细菌被分离出来，其中不少菌株还被开发成商品制剂， 得到广泛的推广应用。这 些商品化制剂中则以芽抱杆菌制剂居多，这应归因于芽抱杆菌所具有的良好生防 性能、抗逆性和易加工性等特性。目前应用的芽抱杆菌种类主要有枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、蜡状芽抱杆菌和短小芽抱杆菌等。例如，Silveria 等人的研究发现巨大芽抱杆菌、蜡状芽抱杆菌和凝结芽抱杆菌3种细菌对番茄青 枯病具有较好的防治作用，同时还能提高番茄种子的发芽率。AGRAQUEST公司利用枯草芽抱杆菌QST713开发的活菌制剂Serenade”，被成功用于防治多种 作物的霜霉病、白粉病和灰霉病等。诺维信公司
15、生产的菌剂Taegro（含枯草芽抱 杆菌）施用于温室或者室内树苗、灌木和装饰植物的根部，可有效防治由镰刀菌 属和丝核菌属引起的根腐病和枯萎病。截止目前，美国已经有5株枯草芽抱杆菌生防菌株获得环保局（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可。另外，我国的科 技人员也对芽抱杆菌属生防菌开展了大量研究工作，陈志谊等人研究了枯草芽抱 杆菌B-916对水稻纹枯病和稻曲病的防治机理，并开发了产品“纹曲宁”，其平 均防效可达70%以上29。韩艳霞等人的研究表明蜡状芽抱杆菌 B3-7菌株对小麦 全蚀病菌具有很强的抑制能力，可有效降低小麦全蚀病的发病程度30。童蕴慧等人证实地衣芽抱杆菌W10对灰葡萄抱（Botry
16、tis cinerea）引起的番茄灰霉病的防 治效果与化学药剂腐霉利相当310另一类被广泛研究和应用的生防细菌是假单胞菌，它们中有很多能产生抗菌物质，如硝叱咯菌素、藤黄绿脓菌素、二乙酰藤黄酚等。 Gupta等人（ 1999）发 现铜绿假单胞菌 GRC1能产生水溶性绿脓菌素，对由 Macrophomina phaseolina 和Fusarium oxysporum引起的土传病害具有很强的拮抗能力 32。郑爱萍等人（2003）证实致黄假单胞菌（Pseudomonas aureofaciens对水稻纹枯病菌菌丝有 强烈的致畸作用，并能抑制菌核的萌发，田间防效高于井冈霉素330 Fernando等人（ 200
