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1、尿素SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.试剂的配制30%凝胶母液丙烯酰胺和N, N -亚甲双丙烯酰胺。以温热(利于溶解双丙烯酰胺)的去离子水配制含有29.2 % (w/v )丙烯酰胺和0.8 % ( w/v ) N, N -亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。4倍SDS分离胶缓冲液(4X , pH 8.8) (200 ml)称取 SDS 0.8 g (4%), Tris 36
2、.342 g (1.5mol/L),溶解(必要时加热)，用盐酸调 pH 为 8.8,定容至200 mLo4倍SDS浓缩胶(堆积胶或积层胶)缓冲液。(4X, pH 6.8) (100 ml)称取SDS 0.4 g (4%), Tris 6.051 g (0.5mol/L),溶解(必要时加热)，用盐酸调pH为6.8,定 容至100 mLo TEMED(N,N,N ,N -四甲基乙二胺)。TEMED通过催化过硫酸钱形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。10%过硫酸钱。0.5 g过硫酸钱溶于5 mL去离子水中，可于 4 C下存放数月Tris-甘氨酸电极缓冲液(1 L)称取 3g Tris (25
3、 mmol/L ) ,14.4 g甘氨酸(192 mmol/L),1 g SDS (0.1 %)，溶解后定容至1L, pH应该在8.3左右。也可以制成10X的储存液在室温下长期保存。样品处理液(5X样品缓冲液)(10 mL)称取 Tris 0.07266 g Tris (60 mmol/L), SDS 0.02 g (2%, W/V),溶于 4 mL 水中,用 HCl 小心调 节 pH 为 6.8,再力口 5 mL 50% 的甘油(终浓度 25%, V/V) , 0.5 mL 2-疏基乙醇(14.4 mmol/L), 澳酚蓝0.01 g终浓度0.1%),加去离子水至10 mLo可以在4c下存放
4、数周，或在20c下 保存数月。考马斯亮蓝 R250染色液( 1000 mL)0.1%考马斯亮蓝 R250考马斯亮蓝 R-250 1.0 g (0.1%, W/V)无水乙醇 450 mL (45%, V/V)冰醋酸 100 mL (10%, V/V)加水定容至1000 mL脱色液(1000 mL)无水乙醇 100mL (10%, V/V)冰醋酸 100mL (10%, V/V)加水定容至1000 mL 2 .尿素SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 根据厂家说明书安装玻璃板 。（琼脂封口） 确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。（一旦加入 TEMED
5、 ,马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并 进入下步操作。）配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 15 %分离胶溶液（20mL/电泳板，pH8.8）水2.4mL尿素7.2g分离胶缓冲液5mL30%凝胶母液4. mL混匀后，加入10% AP 100 科L, TEMED 10 迅速馄合。 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间 （梳子的齿长再加0.5cm）。再在胶液面上小心注入一层水（约 23 mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液（4）分离胶聚合完全后（约 3060分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓
6、度的丙烯酰胺溶液。（一旦加入TEMED ,马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。）配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 5%浓缩胶溶液（10 mL/电泳板，pH6.8） 水5.75mLJ浓缩胶缓冲液2.5 mL30%凝胶母液1.75 mL混匀后，加入10% AP 66 科L, TEMED 10 迅（速Lg合。聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按4:1体积比加入样品处理液，在100c 加热34分钟以使蛋白质变性。浓缩胶聚
7、合完全后（3060分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各 加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 按预定顺序加样，加样量通常为1025山（1.5 mm厚的胶）。（10）将电泳装置与电源相接，凝胶上所加恒电流为 10 mA。当染料前沿进入分离胶后，把电流提高到15 mA,继续电泳直至澳酚蓝到达分离胶底部上方约0.5 cm,然后关闭电源。（11）从电泳装置上卸下玻璃板，轻轻撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。3.用考马斯亮蓝对 SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色染色12小时或过夜。脱色液：脱色需 310小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。此方法检测灵敏度为 0.21.0g。脱色后，可将凝胶浸于水中， 长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。（此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容, 供参考，感谢您的配合和支持）
