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1、大鼠内皮型NO合酶(eNOS)酶联免疫分析试剂盒使用说明书96T本试剂盒仅供研究使用。检测范围：2.5mc/L -80 卩 mc/L使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中内皮型NO合酶(eNOS)含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠内皮型NO合酶(eNOS)水平。用纯化的大鼠内皮型NO合酶(eNOS )抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 内皮型NO合酶(eNOS),再与HRP标记的内皮型 NO合酶(eNOS)抗体结合，形成抗体- 抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成 蓝色，并在酸的作用下转
2、化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内皮型NO合酶(eNOS)呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠内皮型NO合酶(eNOS)浓度。 试剂盒组成130倍浓缩洗涤液20ml X 1 瓶7终止液6ml X 1 瓶2酶标试剂6ml X 1 瓶8标准品(160 i m(/L)0.5ml X 1 瓶3酶标包被板12孔X 8条9标准品稀释液1.5ml X 1 瓶4样品稀释液6ml X 1 瓶10说明书1份5显色剂A液6ml X 1 瓶11圭寸板膜2张6显色剂B液6ml X 1/瓶12密封袋1个标本要求1 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽
3、快进行实验。若不能 马上进行试验，可将标本放于 -20 C保存，但应避免反复冻融2. 不能检测含 NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。801 mo/lL5号标准品1501的原倍标准品加入150 1标准品稀释液40 i mo/lL4号标准品1501的5号标准品加入150 1标准品稀释液20 i mo/lL3号标准品1501的4号标准品加入150 1标准品稀释液101 mo/lL2号标准品1501的3号标准品加入150 1标准品稀释液5 i mc/L1号标准品1501的2号标准品加
4、入150 1标准品稀释液2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50山,待测样品孔中先加样品稀释液40山,然后再加待测样品10 d （样品最终稀释度为 5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置 37 C温育30分钟。4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30倍稀释后备用5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50 d，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同
5、5。9. 显色：每孔先加入显色剂 A50 d，再加入显色剂 B50 d，轻轻震荡混匀，37 C避光显色 15分钟.10. 终止：每孔加终止液 50 d，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（ OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。操作程序总结：准备试剂，样品和标准品计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式， 将样品的 OD 值代入方程式， 计算出样品浓度， 再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓
6、度。 注意事项 1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（XnX 5）O5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6.底物请避光
7、保存。7严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.&所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9本试剂不同批号组分不得混用。10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。保存条件及有效期1. 试剂盒保存：；2-8Co2. 有效期： 6 个月Mouse nitric oxide synthase(NOS )FOR RESEARCH USE ONLYAssay range 2.5 卩 m(/L -80 卩 mot96 determ in ati onsPurposeThis kit allowsfor the determ in atiorof NOS concen trati
8、 onjn Mouseserum,cell culture super nates and other biological fluidsPrinciple of the assayThe kit assay Mouse NOS level in the sampluse Purified Mouse NOS an tibody to coat microtiterplate wells, make solid-phasea ntibody,the n add NOS to wells, Comb ined antibody which With HRP labeled goat anti-
9、Mouse become antibody - antigen - en zyme-a ntibodycomplex, after washi ng Completely,Add TMB substrate solutio n,TMB substrate becomes blue color At HRP en zyme-catalyzed, react ion is termi nated by the additi on of a sulphuricacid soluti onand the color cha ngeis measuredspectrophotometricallyt a
10、 wavelength of 450 nm. The concentration of Mouse NOS in the samples is then determined by compari ng the O.D. of the samples to the sta ndard curve.Materials provided with the kit1wash solution20ml Xbottle7Stopp Soluti on6ml X bottle2HRP-C on jugate reagert 6ml 1 bottle8Sta ndard(160 卩 molL)0.5ml X
11、bottle3Microelisa stripplate12well8strips9Stan dard dilue nt1.5ml Wottle4Sample dilue nt6ml 1 bottle10In structio n15Chromoge n Soluti on A6ml 1 bottle11Closure plate membra ne26Chromoge n Soluti on E6ml 1 bottle12Sealed bags1Specimen requirements1. extract as soon as possibleafter Specime ncollecti
12、 on,an daccord in gto the releva nt Iiterature,a nd shouldbe experime nlas soon as possibleafter the extractio n.lf it can specime n can be kept in -20 to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.2. Can t detect the sample which conaN3, because NaN3 inhibits HRP active.Assay procedure1. Dilute an
13、d add sample:DilOteinai density Standard as follow table:80 mc/lL5 Sta ndard150 d Original density Standard150 M Standard diluent40 mdL4 Sta ndard150 d 5 Standard150 M Standard diluent20 mo/lL3 Sta ndard150 M 4 Standard150 d Standard diluent10 mo/lL2 Sta ndard150 d 3 Standarc+150 d Standard diluent5
14、mdL1 Sta ndard150 d 2 Standarc+150 d Standard diluent2.add sample Set blank wells separately(blank comparisorwells don atdd sampleandHRP-Conjugate reage nt, other each step operatio n is same). test ing sample well. add Sample diluti on40 ytlo test in gsamplewel, the n add testi ng samplelO y(sample
15、fi nal diluti onis 5-fold), add sample to weldon t touch the well wall as far as poanibGently mix.3.ln cubate: After closi ng plate with Closure plate membra ne ,in cubate for 30CBnin at 374. C on figurate liquid: 30-fold wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled water and reserve.5. washi ng Un cover Closure plate membra ne, discard Liquid, dry by swing, add wash ing buffer to eve
