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1、实验八 饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析一、实验目的1进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。2巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。3掌握外标法定量及 Origin 软件绘制标准曲线。二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为 1，3，7三甲基黄嘌呤， 是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。咖 啡因在咖啡中的含量约为1.2%1.8%，在茶叶中约为2.0%4.7%。可乐饮 料、止痛药片等均含咖啡因。咖啡因的分子式为CHON，结构式为：8 10 2 4OHC-N N-CH3人口 3ICH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相
2、的极 性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。反之，若流动相的 极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为 广泛。本实验采用反相液相色谱法，以 C 键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，18 紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线 再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。三、实验仪器和试剂1岛津LC-20A高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR）,超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液 配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。（2）标准系列溶液
3、 用上述贮备液配置含咖啡因 10ug/mL， 20ug/mL， 40ug/mL 50 ug/mL， 60 ug/mL 的甲醇溶液，备用。4. 试样 市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件1. 色谱柱（XDB-C） 颗粒度为5 um的固定相，长150 mm内径4.6 mm2. 流动相 甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min3. 检测器 紫外光度检测器， 270 nm4. 进样量 10 uL五、实验步骤1. 制备所需的流动相，有机溶剂用0.45pm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45pm 的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气 20 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声
4、波发生器上脱气 15 min.3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。根据分析要求设定柱 温箱的温度，没有柱温要求的，设为25C。4. 待检测器波长检测：出现“CHECK GOOD”，仪器自检完成。此时打开A泵、B 泵的DRAIN 阀，用脱气后的流动相依次进行purge。关闭A泵、B泵的DRAIN 阀。5. 清洗进样阀。用脱气后的流动相在进样阀的LOAD状态及INJECT状态下来 回几次彻底清洗。清洗后进样阀停留到LOAD状态。6. 根据分析要求，在 A 泵按 func 输入流量按 enter 确认，按 conc 输B泵的浓度按enter 确认后按CE返回初始界面。开始泵的运行。
5、7. 待仪器稳定后，按标准溶液浓度递增的顺序，由稀到浓依次等体积进样 10ul（每个标样重复进样3次），准确记录各自的保留时间。8. 同样取 10ul 待测饮料试液进色谱分析（重复 3 次），准确记录各个组分的保 留时间。9. 根据标准物的保留时间确定饮料中的咖啡因组分峰，计算系列咖啡因标准物 和待测咖啡因的峰面积（3 次平均值）。10. 以标准物的峰面积对相应浓度做工作曲线。 11.11. 实验结束后做好仪器使用情况登记，经实验指导老师签名后方可离开实验室。六、实验数据及处理1. 处理色谱数据，将标准溶液及试样中咖啡因的保留时间及峰面积列于表中。保留时间t/min峰面积A/mVs标准溶液10
6、 ug/mL标准溶液20 ug/mL标准溶液40 ug/mL标准溶液60 ug/mL标准溶液80 ug/mL标准溶液100 ug/mL可口可乐百事可乐2. 用相关软件绘制咖啡因峰面积质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相 关系数。3. 根据试样溶液中咖啡因的峰面积值，计算可口可乐和百事可乐中咖啡因的质 量浓度。七、思考题1. 解释用反相柱（ODS）测定咖啡因的理论基础。2. 能否用离子交换色谱柱测定咖啡因？为什么？六、实验数据及处理1.处理色谱数据。表一：标准溶液的实验数据浓度卩g / mL组号保留时间t /minR峰面积A / mV - s峰高1010-14.782189556.311574
7、.210-24.784201204.91219 8.610-34.786192967.811735.6平均值4.784194576.311836.12020-14.786357779.621735.220-24.787368395.122277.920-34.786371051.322449.7平均值4.786365742.022154.34040-14.786695127.342265.340-24.787702897.042691.240-34.788685887.641805.7平均值4.787694637.342254.15050-14.785957336.957290.350-24.
8、789947785.956727.950-34.787944831.856453.7平均值4.787949984.956824.06060-14.868108173564867.960-24.789110635066384.160-34.791106658964061.7平均值4.816108489165104.6表二：试样溶液的实验数据名称编号保留时间t /minR峰面积A / mV - s峰高白事可乐（ImL）14.794216430.612697.424.793221488.612937.334.793220618.012930.6平均值4.793219512.412855.1可口可乐（
9、ImL）14.794193551.911272.924.797192648.311268.434.799196739.211492.4平均值4.797194313.111344.62.绘制咖啡因峰面积-质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。表三：绘制咖啡因标准溶液峰面积-质量浓度的标准曲线数据咖啡因峰面积-质量浓度的标准曲线050100浓度（p g/ml）图二：咖啡因标准溶液峰面积-质量浓度的标准曲线所以线性方程为：A=18142c+4840.93根据试样溶液中咖啡因的峰面积值，计算可口可乐和百事可乐中咖啡因的质 量浓度。将 A=219512. 4代入 A=18142c+4840. 9
10、得 C=11.8p g/mLc = 11. 8 x 10mL yg/mL = 118yg/mL即百事可乐中咖啡因的质量浓度 百事可乐1mL为 118 C=11.8p g/mL （2）可口可乐中咖啡因的质量浓度将 A=194313.1 代入得 A=18142c+4840.9 得 C=10.4U g/mLc = 10. 4 x 10mL yg /mL = 104yg /mL,即可口可乐中咖啡因的质量浓度 可口可乐1mL为 104 g/mL 七思考题。1解释用反相柱（ODS ）测定咖啡因的理论基础。答：反向色谱法中流动相的极性大于固定相，利用样品中各组分在色谱柱中 固定相和流动相之间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行检测，并 根据各组分的保留时间和响应值进行定性、定量分析。2.能否用离子交换色谱柱测定咖啡因？为什么？答：不能，因为离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定 离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时, 组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换，根据组分离子对树脂亲合力 不同而得到分离。
