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1、人类免疫缺陷病毒 1 型 p24 抗原酶联免疫试剂盒说明书【产品名称】通用名：人类免疫缺陷病毒1型p24抗原酶联免疫试剂盒英文名： ENZYME IMMUNOASSAY FOR DETECTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I P24 ANTIGEN IN HUMAN SERUM, PLASMA AND CELL CULTURE SUPERNATANT【包装规格】96 人份/盒。【预期用途】本试剂盒用于人类免疫缺陷病毒1型p24抗原（Human Immunodeficiency Virus Type 1 p24 Antigen）的 定量检测，适用
2、于人血清（或血浆）及细胞培养上清液等标本，仅供研究使用。【检验原理】本产品采用固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测人血清（或 血浆）中的游离HIV-1 p24抗原和细胞培养上清液等标本中的HIV-1 p24抗原。本分析方法是基于双抗体 夹心的非竞争性免疫分析。校准品和样品中HIV-1 p24抗原与固相抗-p24单克隆抗体和生物素标记的抗 -p24多克隆抗体通过免疫反应，形成固相抗-p24单克隆抗体p24抗原一抗-p24多克隆抗体-生物素复合物； 温育后洗涤，洗去非特异或多余的抗原和多余的生物素标记的抗 - p24 多克隆抗
3、体；然后加入 HRP （Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的链亲和素，形成固相抗-p24单克隆抗体一p24抗原一 抗-p24多克隆抗体-生物素一链亲和素-HRP复合物；温育后洗涤，洗去多余的HRP标记的链亲和素。加入 TMB-H2O2底物溶液，HRP催化H2O2氧化TMB生成蓝色的产物（最大吸收峰655nm），加入终止液终止 酶催化反应，生成黄色产物（最大吸收峰450nm）。其吸光度与校准品和样品中的HIV-1 p24抗原浓度成 正相关。通过剂量一反应曲线可得出样品中HIV-1 p24抗原浓度。试验类型温育时间试验所需时间试验温度试验所需样本体积免疫度量分析12
4、0分钟大约150分钟37C和室温（1830C）75“L反应原理图：MicrowellAbsorbance主要组成成份】1.抗体包被板(Antibody Coated Microplate)1块包被有鼠抗-HIV-1 p24单克隆抗体的聚苯乙烯微 孔板，约200ng/孔。8 孔x12条。铝箔袋密封包装，含干燥剂。标签编号为R1。2.HIV-1 p24抗原校准品(HIV-1 p24 Antigen Calibrator)ImLxl 支重组HIV-1 p24抗原溶液，200IU/mL （约相当于 4,000pg/mL）,稀释液为校准品稀释液。用英国国 家 生 物 标 准 与 检 定 所 （Natio
5、nal Institute for Biological Standards and Control, NIBSC） 提供的 WHO 标准品（HIV-1 p24 Antigen 90/636）校准。绿色 PP 盖子和无色 PP 塑料管。标签编号为 R2。3.校准品稀释液（Calibrator Diluent）20mLxl 瓶磷酸盐缓冲液，含动物血清和钙化的正常人血浆（经 ELISA 检测，HBsAg、抗-HCV 和抗-HIV 1+2 均为阴性），pH约7.3。防腐剂为NaN3 （不超过 0.1%）和 EDTA。绿色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R3。4.生物素标记抗体（Bio
6、tinylated Antibody）5mLx1 瓶生物素标记的兔抗 -HIV-1 p24 多克隆抗体，约 4卩g/mL。缓冲液为Tris-HCl,含动物血清、稳定剂、 表面活性剂和绿色染料， pH 约 7.4。防腐剂为 NaN3 （不超过 0.1%）。蓝色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R4。5.HRP 标记链亲和素(HRP Conjugated Streptavidin)20mLx1 瓶HRP标记链亲和素，约0.1卩g/mL（ 25mU/mL HRP）。 缓冲液为Tris-HCl，含动物血清、稳定剂、表面活 性剂和红色染料， pH 约 7.4。防腐剂为 ProClin300
7、（不超过 1%）。红色 PP 盖子和棕色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R5。6.浓缩洗涤液(Concentrated Wash Buffer)50mLxl 瓶含表面活性剂的磷酸盐缓冲液， 20 倍浓缩。防腐剂为 ProClin300 （不超过 1%）。无色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R6。R7。8. 显色剂10mLx1瓶 含TMB的乙酸溶液，pH约3.0。( Chromogen Solution)白色 PP 盖子和棕色 HPDE 塑料瓶。标签编号为R8。9. 终止液10mLx1 瓶 2mol/L H2SO4 溶液。( Stop Solution)黄色 PP 盖子和无色 HP
8、DE 塑料瓶。标签编号为R9。10. 封板膜6 张用于温育时微孔板的密封。( Plate Sealer )11. 说明书1 份本产品使用说明。( Instruction for Use)【储存条件及有效期】lOmLxl瓶 含H2O2的乙酸盐缓冲液，pH约5.0。无色 PP 盖子和无色 HPDE 塑料瓶。标签编号为试剂盒置28C保存，有效期为12个月。适用仪器】7. 底物缓冲液(Substrate Buffer)酶标仪、洗板机、恒温培养箱等。【样本要求】1. 样本：人血清(或血浆)样本，和细胞培养上清液等标本。2. 存放：样本于28C可储存2天；样本长期储存应放置于-20C或-20C以下环境中，
9、且不宜反复冻融5 次以上。【检验方法】1. 试剂配制方法A、HIV-1 p24校准品系列的配制：取6支离心管，编号A、B、C、D、E和F。管F中取900卩L校准品稀释液，加入100卩L HIV-1 p24 校准品(200IU/mL, 4,000pg/mL),混匀，作 1:10 稀释，配制成校准品 F (20IU/mL, 400pg/mL)；管 E中取500卩L校准品稀释液，加入500卩L校准品F,混匀，作1:2稀释，配制成校准品E (10IU/mL， 200pg/mL)；管D中取500卩L校准品稀释液，加入500卩L校准品E,混匀，作1:2稀释，配制成校 准品D (5IU/mL，100pg/m
10、L)；管C中取500卩L校准品稀释液，加入500卩L校准品D,混匀，作1:2 稀释，配制成校准品C (2.5IU/mL, 50pg/mL)；管B中取500卩L校准品稀释液，加入500卩L校准品C, 混匀，作1:2稀释，配制成校准品B (1.25IU/mL, 25pg/mL)；以校准品稀释液作为校准品A。共配制 成 6 个浓度的 HIV-1 p24 校准品系列(A-F)：A 0、B 125IU/mL(25pg/mL)、C 25IU/mL(50pg/mL)、D 5IU/mL (100pg/mL)、E 10IU/mL (200pg/mL)和 F 20IU/mL (400pg/mL)。配制好的 HIV
11、-1p24校准品系列应保存在28 C，于一月内使用。校准品浓度离心管编号校准品稀释液加入20IU/mL( 400pg/mL)F900卩L100卩L R210IU/mL( 200pg/mL)E500pL500卩L管F5IU/mL( 100pg/mL)D500pL500卩L管E2.5IU/mL( 50pg/mL)C500pL500卩L管D1.25IU/mL( 25pg/mL)B500pL500卩L管CB、工作浓度洗涤液的配制：用纯水（蒸馏水或去离子水）将浓缩洗涤液稀释 20 倍，即为工作浓度洗涤液。工作浓度洗涤液 应保存在28C，于一月内使用。2. 标准操作方法A、从铝箔袋中取出所需数量的微孔板条
12、，装至微孔板架上。设空白对照1孑L, HIV-1 p24校准品A、B、C、 D、 E 和 F 各 2 孔，其余各孔为待测样品，建议每个待测样品均设置2 孔；编号标记。向各孔内分别加入25吐的生物素标记抗体（空白对照孔不加），然后再向各孔内分别加入75吐的 HIV-1 p24校准品或待测样品，轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀。B、用封板膜将微孔板密封，置37C温育60分钟。C、弃去微孔板反应孔内液体，每孔（含空白对照孔）加入350yL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃 去。重复洗板共 5 次，最后拍干。D、每孔加HRP标记链亲和素100吐（空白对照孔不加），用封板膜将微孔板密封，置37C温育30 分
13、钟。E、弃去微孔板反应孔内液体，每孔（含空白对照孔）加入350gL工作浓度洗涤液，然后将洗涤液弃 去。重复洗板共 5 次，最后拍干。F、每孔加底物缓冲液和显色剂各50gL（含空白对照孔），用封板膜将微孔板密封，置室温（1830C） 避光温育 30 分钟。G、每孔加终止液50gL （含空白对照孔），轻轻振荡微孔板，使内容物充分混匀。H、终止反应后 1 小时内，用酶标仪在 450nm 波长处，测定各孔吸光度值，参考波长选择 620-700nm。3. 数据处理A、求出HIV-1 p24抗原校准品的吸光度平均值。B、以HIV-1 p24抗原校准品的吸光度平均值为纵轴，以HIV-1 p24校准品的浓度为
14、横轴，在双对数坐 标图上作出标准曲线。C、如果待测样品试验了 2孔，求出待测样品的吸光度平均值。D、将测得的样品的吸光度值(或吸光度平均值)在上述标准曲线上求出样品中的HIV-lp24抗原的浓度。也可以通过软件用最小二乘法拟合曲线，求出样品中的HIV-1 p24抗原的浓度。【检验结果的解释】1. 质量控制:空白对照校准品吸光度值不高于0.050, A点(Opg/mL)吸光度值不高于0.100, F点(400pg/mL) 吸光度值不低于 1.000。2. 对于吸光度值超出校准品 F 点的样品，可用校准品稀释液稀释适宜倍数后再行测定，样本中 HIV-1 p24 抗原浓度值为稀释后测定值x稀释倍数。
15、【检验方法的局限性】1. 本品仅适用于研究用途，不用于临床诊断。2. 本品仅适用于游离的HIV-1 p24抗原含量的检测，不能用于总抗原含量的检测。3. 样本 pH 应保证在 5-10 之间，过低或过高的 pH 可能会造成 HIV-1 p24 抗原的测量值异常。 【产品性能指标】1. 测定范围: 0400pg/mL。2. 分析灵敏度:最低检测限不高于 5pg/mL。3. 校准品剂量-反应曲线的线性：线性相关系数R0.9900。典型校准曲线如下图HIV-1 p24 Antigen ELISAoEu 口 Ea/EUCIg 寸)aoucoqosqvJI o o10.1 1 10HIV-1 p24 Antigen Concentration(U/mL)4. 精密性：批内变异系数(Within-Run CV)不高于10%,批间变异系数(Between-Run CV)不高于15%。5. 特异性:与 HIV-1 和 HIV-2 的
