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1、毕业论文(设计)题目学 院学院专业学生姓名学 号年级级指导教师教务处制表二O三年三月二十日复发性口腔溃疡口腔微生态的研究摘要 相关的文献研究表明，在慢性胃癌病患者口腔牙菌斑、唾液中以及胃内能 同事检测出幽门螺旋菌(Helicobacter pylori,HP)，而伴有HP感染的复发性口腔溃疡 (recurrent oral ulcer,ROU)患者的消化道疾病的发病率也明显上升，提示口腔为Hp 重要的聚集地之一，Hp感染与ROU发病之间可能存在一定的内在联系。结合既往史的相 关证候研究提示的脾胃湿热证为Hp相关疾病发生过程中邪气最盛、邪正交争最剧烈的阶 段，及Hp感染率较高之观点，初步提出：临
2、床ROU反复发作的原因部分可能是缘于湿热 粘滞及致病隐匿、渐进和缠绵的特征以及Hp感染：脾胃受损，云华失调，湿热内蘊，熏 蒸口舌可能是ROU缠绵难愈的关键病机之一，脾胃湿热、Hp感染与ROU发病存在一定的 内在联系。口腔中Hp感染的相关研究的真实情况，有关脾胃湿热、Hp感染与ROU发病关 系的探讨应引起必要的重视。【论文主要内容】：研究背景、目的和意义复发性口腔溃疡(Recurrent Oral Ulcer,ROU),又称“复发性 口疮” “复发性阿弗他溃疡(Recurrent Aphthous Ulcer,RAU)或“复发性阿弗他口炎 (Recurrent Aph thous St oma
3、tit is,RAS),是专指一类原因不明，具有周期性反复发作但又 具自限性的局限性口腔粘膜溃疡性损伤。该病是口腔粘膜病中最常见的溃疡类疾病,患病 率高达20%左右,居口腔粘膜病首位。复发性口腔溃疡发病时病变部疼痛剧烈,对患者工作 与生活造成重要影响。临床尚无明确有效的治疗方法。因此,ROU的病因及发病机制研究 对进一步的临床治疗研究具有重要作用。本病病因至今不清，多方面的病因研究表明,ROU 的发生发展可能与多种因素有关。国内外文献已报道的病因方面的研究包括免疫学异常, 病毒、细菌感染,微量元素、精神神经因素、遗传因素影响及微循环障碍等,但尚无确切 定论。正常人体的口腔、肠道、呼吸道、泌尿生
4、殖道等,均定植一定数量的细菌,它们与 宿主在长期进化过程中形成了一个能独立进行物质、能量交流的动态平衡的微生态系统。 定居于口腔中的菌群称为口腔正常菌群,它与宿主呈共栖的关系,他们彼此之间保持着动 态平衡,对宿主起着有益和有害的双重作用。口腔中的细菌,在正常情况下对宿主有多种 有益的生理作用:如抵抗外来致病菌、产生多种营养物质、促进免疫应答、产生过氧化物 歧化酶(SOD)、清除自由基(0_2-)及抗肿瘤等作用。一旦微生态平衡遭到破坏，发生菌群 失调，上述生理作用发生改变,对宿主可能造成损伤。有学者提出ROU的发生发展可能与 多因素相互作用有关。多方面的病因研究表明,ROU的发生发展可能与多种因
5、素有关。口 腔内环境与这些因素有着密切的关系。那么，ROU的发生发展是否与口腔的微生态相关呢 ROU 患者口腔微生态是否发生了变化又是哪些方面发生变化本研究将从口腔菌群变化及 口腔菌群构成的角度,探讨复发性口腔溃疡是否与口腔微生态变化有关,为口腔溃疡的防 治探索新的依据。材料和方法一、唾液菌群涂片观察收集临床唾液标本共62例。将其分 为溃疡组、愈合组及正常对照组三组。溃疡组为临床确诊并处于溃疡期的20例ROU患者， 其中男性6例，女性14例，平均年龄土岁；愈合组为临床确诊并处于愈合期的21例ROU患 者，其中男性9例，女性12例，平均年龄土岁；对照组为无ROU病史的21位健康成年人，其 中男性
6、9例,女性12例,平均年龄土岁。所有受试者均符合以下纳入标准:所有受检查者 取样前1周内未服用任何抗生素、铋剂、抗酸剂及H_2受体拮抗剂，1月内未服用类固醇 药物或非类固醇类抗炎药，如阿司匹林等；无其他系统疾病；无其他口腔黏膜病:无中、重 度牙周病。方法:唾液标本直接涂片，革兰氏染色，在显微镜10X100油镜下，选取分布均 匀的5个视野，分别计数各视野下细菌中革兰氏阳性球菌(简称G+c)、革兰氏阴性球菌 （简称G-c）、革兰氏阳性杆菌（简称G+b）、革兰氏阴性杆菌（简称G-b）所占的构成比， 然后求其均值。分析了不同菌群间的比值及构成比的变化。统计学分析:用统计学软件, 对不同组别四类细菌的构
7、成比及不同菌群间的比值采用单因素方差分析（One-way ANOVA）, 采用Dunnett T3法进行两两比较，以PV为差异有统计学意义。二、复发性口腔溃疡口腔 唾液中链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌的定量分析收集符合纳入标准的临床标本,共95例。 纳入标准参考第一章。将其分为溃疡组、愈合组及正常对照组三组。溃疡组为临床确诊 并处于溃疡期的39例ROU患者，其中男性13例，女性26例，平均年龄土岁；愈合组为临床 确诊并处于愈合期的35例ROU患者，其中男性11例，女性24例,平均年龄土岁;对照组为 无ROU病史的21位健康成年人，其中男性9 例,女性12 例,平均年龄土岁。方法:用引物 设计软件P
8、rimerprimer设计三种常见口腔细菌（链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌）16S rRNA 基因扩增引物，并验证其特异性;采用改良CTAB/NaCl法提取细菌标本DNA;通过实时荧光 定量PCR检测链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌三种常见口腔细菌的含量。统计学分析:用统 计学软件，对不同组别三种细菌的含量采用单向方差分析（One-way ANOVA）,采用Dunnett T3法进行两两比较，以PV为差异有统计学意义。三、基于细菌16S rRNA基因分析的复 发性口腔溃疡口腔细菌构成差异分析分别收集符合纳入标准的唾液标本30例，纳入标准 参考第一章。将其分为溃疡组、愈合组及正常对照组三组，每组10例。溃
9、疡组为临床确 诊并处于溃疡期的ROU患者;愈合组为临床确诊并处于愈合期的ROU患者;对照组为无ROU 病史的健康成年人。方法:采用改良CTAB/NaCl法提取细菌标本DNA，并且制备成混合标 本。用细菌 16S rRNA 通用引物扩增混合标本，琼脂糖凝胶电泳，用 AlphaEaseFCStand Alone软件行凝胶图像分析。选择回收纯化差异较明显的条带，测定片段序列并在GenBank 中比对，分析差异条带的种属源性。实验结果一、唾液菌群涂片观察溃疡组、愈合组及对 照组G+c构成比分别为：土、土及土； G+b构成比分别为：土、土及土； G-b构成比分别 为：土、土及土。溃疡组、愈合组及对照组G
10、+c、G+b及67构成比差异无统计学意义 （P二、P二、P=。溃疡组、愈合组及对照组G-c构成比分别为：土、土及土；三组间G-c构 成比差异具有显着性（P=;溃疡组G-c构成比较愈合组及对照组分别下降了及个百分点。 溃疡组、愈合组及对照组球菌构成比均在90%以上，三组总球菌的构成比分别为:土、土及 土;总杆菌的构成比分别为:土、土及土。溃疡组、愈合组及对照组总球菌及总杆菌构成 比差异均无统计学意义（P=、P=。溃疡组、愈合组及对照组G+c/G-c比值分别为：土、 土及土；G+b/G-b 比值分别为：土、土及土；G+c/G+b 比值分别为：土、土及土 ;G-c/G-b 比值分别为：土、土及土。三
11、组间G +c/G -c、G +c/G +b及G -c/G -b差异均无统计学 意义(P二、P二、P二,G+b/G-b在三组间存在差异，P=。溃疡组、愈合组及对照组 G+c/(G+c+G+b)构成比分别为：土、土、土；G+b/(G+c+G+b)构成比分别为：土、土、 土；G-c/(G-c+G-b)构成比分别为：土、土、土；G-b/(G-c+G-b)构成比分别为：土、 土、土； G+c/(G+c+G-c)构成比分别为：土、土、土； G-c/(G+c+G-c)构成比分别为： 土、土、土; G+b/(G+b+G-b)构成比分别为：土、土、土; G-b/(G+b+G-b)构成比分别 为：土、土、土。三组
12、间 G+c/(G+c+G+b) 、 G+b/(G+c+G+b) 、 G-c/ (G-c+G-b) 、 G-b/(G-c+G-b) 、 G+c/(G+c+G-c) 、 G-c/(G+c+G-c) 、 G+b/(G+b+G-b) 、 G-b/(G+b+G-b)构成比差异均无统计学意义(P二、P二、P二、P二、P二、P二、P二、P=。溃疡 组、愈合组及对照组G+/G-比值分别为：土、土、土；Gc/Gb比值分别为：土、土、土。 三组间G+/G-、Gc/Gb差异均无统计学意义(P二、P=。二、复发性口腔溃疡口腔唾液中 链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌的定量分析溃疡组链球菌及韦荣氏菌含量的对数值分别为 土和土，
13、均显着低于对照组土和土，PV，链球菌及韦荣氏菌含量分别较对照组降低了 66% 和86%；溃疡组与愈合组间链球菌及韦荣氏菌的含量的对数值差异均无统计学意义(P=、P二; 愈合组链球菌含量的对数值为土，显着低于对照组土，PV,菌量较对照组降低67%,愈合组 与对照组间韦荣氏菌含量的对数值差异统计结果P=；奈瑟氏菌含量的对数值在三组间的 差异均无统计学意义(P=。三、基于细菌16S rRNA基因分析的复发性口腔溃疡口腔细菌 构成差异分析在200-800bp区间，于溃疡组、愈合组及对照组均稳定识别出3条碱基数分 别为230bp、400bp及770bp左右的三条条带。溃疡组、愈合组及对照组三条条带灰度值
14、 的百分比有差异。在溃疡组、愈合组及对照组条带组成方面存在差异，各组在不同位置均 有条带缺失现象。条带综合波形图也反映了溃疡组、愈合组及对照组在条带含量构成方 面存在差异。选择回收纯化片段暂命名为1号,片段大小约为180bp。测序结果通过生物 信息学分析。1号biast比对结果示1号差异条带70%与GenBank中Bacteroides vulqatus ATCC 8482同源，匹配率74%。结论1、溃疡组、愈合组及对照组唾液菌群以球菌为主，溃 疡组革兰氏阴性球菌构成比减少，表明复发性口腔溃疡唾液菌群构成发生了变化。2、复 发性口腔溃疡患者唾液中链球菌、韦荣氏菌含量发生了减少性变化，提示构成口
15、腔微生态 的重要球菌菌群链球菌和韦荣氏菌含量的改变与复发性口腔溃疡的发生发展有关。3、细 菌16S rRNA基因扩增琼脂糖电泳及图像分析结果表明，复发性口腔溃疡患者口腔细菌构 成与健康成人的口腔细菌构成存在差异。概言之，复发性口腔溃疡患者口腔菌群构成比及 含量均发生了变化，提示复发性口腔溃疡的发生发展与口腔微生态的变化有关。临床上对 复发性口腔溃疡的治疗应注意口腔微生态的调整和改善。【论文提纲】：中文摘要ABSTRACT.、八、-前言第一章 唾液标本菌群涂片观察.、八、-前言1 材料和方法2 结果3 讨论参考文献第二章 复发性口腔溃疡口腔唾液中链球菌、韦荣氏菌及奈瑟氏菌的定量分析.、八、-前言1 材料与方法2 结果3 讨论参考文献第三章基于细菌16S rRNA基因分析的复发性口腔溃疡口腔细菌构成差异分析.、八、-前言1 材料与方法2 结果3 讨论参考文献全文小结统计合格证明
