果胶酶产生菌的筛选及其条件优化2

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1、实验序号实验7实验名称特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究（一）实验时间 2011.11.15-12.15实验室 118一、实验目的：1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会运用微生物生态知识分离产酶微生物;3、掌握果胶酶活性测定的原理，学会果胶酶活性的测定方法；4、了解酶学性质的研究。二、实验原理1、果胶质：果胶是植物中的一种酸性多糖物质，它通常为白色至淡黄色粉末，稍 带酸味，具有水溶性，工业上即可分离，其分子量约5万30万，主要存在于植 物的细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。果胶质是一类高分子碳水化合物， 普遍存

2、在与高等植物的细胞壁及细胞壁间作为结构物质。2、果胶酶：分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、 果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶 作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成 果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌都可以发酵产生果胶酶，但是目前商品果胶酶主要来自于霉 菌。果胶酶主要用于果胶的分解，在水果的加工、葡萄酒的生产、麻类脱胶和饲料 方面。3、果胶酶的酶活测定方法： 、粘度降低法：利用粘度计测量一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准 果胶溶液的

3、粘度降低值。 、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。 、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活 力。 、还原糖法（DNS法）：测定在一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。 根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸是一种还原糖，与3, 5-二硝基 水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应 液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。4、影响微生物发酵的因素有很多； 、培养基的成分（营养物质及其浓度）例如：碳源的种类、氮源的种类、碳 源的浓度、氮源的浓度、无机盐、水含量等； 、菌种接种的量； 、发酵条件：

4、温度、PH、溶解氧等； 、附加条件：诱导物、表面活性剂等（5）、酶催化反应的进行也受到多方面因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、PH、 激活剂、抑制剂。（6）、果胶酶的最适催化PH为酸性，在3.5左右，而DNS的显色PH为碱性。三、实验设备及材料：1、实验设备：天平、火菌锅、超净工作台、怛温培养箱、电磁炉、怛温水浴锅、 计时器（精确到秒）、分光光度计、离心机、烘箱、PH计数器。2、实验用具：烧杯、三角瓶、试管、移液枪（枪头）、量筒、容量瓶、试剂瓶、 研钵、试管架、玻璃棒、纱布、绳子、离心管、比色皿、培养皿。3、实验试剂： 、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸15.652克，柠檬酸钠7.5克，溶

5、解 定容至 1000ml，用 0.1M NaOH 或 0.1M HCl 调节 PH 至 3.0。 、底物.25%果胶溶液：称取0.25g果胶，用PH=3.0的柠檬酸-柠檬酸 钠缓冲液溶解，在电磁炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于 4 C，7天内有效。 、DNS试剂：称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500mL水中，加热（不超 过50C），于热溶液中依次加入2，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚 5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10 天后过滤使用。4、实验材料：从周围环境采集的土样或腐烂的水果上的霉菌。5、培养基：

6、、基本培养基；成分及条 件果胶磷酸二氢钠蛋白胨琼脂pH含量及水 平1%0.5%1%2.0%4.5、分离培养基；成分及条件果胶磷酸二氢钠 琼脂pH含量及水平0.5%0.5%2.0%4.5、发酵培养基；成分及条件果胶磷酸二氢钠 蛋白胨pH含量及水平1%0.5%1%4.5、种子培养基；成分及条 件麸皮橘子粉 硫酸铵 葡萄糖磷酸二氢pH钾含量及水 平3.0%2.0%0.5%1%0.1%4.5、固体发酵培养基；成分及条 件麸皮橘子粉硫酸铵葡萄糖水含量及水 平10g2.5g0.1g0.125g15mL四、实验步骤（一）、半乳糖醛酸标准曲线的绘制；1、先配制一系列浓度不同的标准曲线溶液，用选定的显色剂进行显

7、色。（1）、精确称取0.100g半乳糖醛酸，用缓冲液定容至100mL，制得浓度为1mg/mL 的半乳糖醛酸的标准溶液。（2）、如下表配制溶液；半乳糖醛酸溶液体 积0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛 酸0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容总体积（ml）20202020202020OD(540n m)0.0000.0850.2410.4050.5500.7030.850（3）、在540nm波长的光下测定他们的吸光度A。（4）、以A为横坐标，浓度c为纵坐标，做出标准曲线。1.51.3623x

8、+0.0484系列i一线性（系列1）15 0O度浓酸醛糖乳半00.20.40.60.81OD值标准曲线（二）、果胶酶产生菌的筛选分离；1、按照上方所说的基本培养基比例称取各组分，称好后将其煮沸溶解。2、灭菌，将煮好融化后的培养基倒入三角瓶内，用8层纱布，一层油布纸和两层 报纸包扎好后置于灭菌锅内灭菌40分钟。3、倒平板，将灭好菌的培养基取出，趁热在超净工作台内将其倒入适量于灭过菌 的培养皿内（10ml左右），待其冷却后凝固备用。4、接种，将采集的土样晾干（本组使用土壤，来自于腐烂柿子下方的土壤），然后 取适量在研钵中研磨细，用食指蘸取少量，在上述倒好的平板上用拇指轻搓一下， 使其均匀的洒落在平

9、板上。5、培养，将接种后的平板用报纸包好，将其置于恒温培养箱内培养36个小时。6、再按照上述分离培养基配方称取各种成分并煮化后置于灭菌锅内灭菌40min，然 后倒平板，冷却凝固备用。7、将基本培养基取出，在超净工作台内用接种针从中挑取菌在配制好的分离培养 基平板上划线分离（可以挑取不同的菌落在不同的平板上划线分离）。8、包扎好后置于恒温培养箱内培养36个小时。9、取出继续划线分离直到得到单一菌落为止。10、找出周围透明圈较大的菌落作为菌种。（三）、菌种的准备：1、照种子培养基的比例称好各物质，并进行灭菌，冷却后待用。2、将从步骤（三）中得到的周围透明圈较大的菌落在超净工作台中接种到种子培 养基

10、中。（选出几个菌种就接种几瓶）（四）、菌种的选择（我们组选择出的菌种为霉菌）：1、配制发酵培养基（本组在菌种的选择时采用液体发酵）并灭菌，数量根据所选 出的菌的数量来定（本组选出了 5个菌种，所以配制了 5瓶）。2、将灭好菌的培养基取出冷却后在超净工作台内编好号（k1,k2,k3,k4,k5,）并接 入对应的菌种5%。3、在30C的恒温摇床内培养48小时。4取出后在超净工作台内各吸取10ml （5ml）发酵液于对应编号的离心管内在离 心机内离心5min。5、取15支试管分别标上1空、1A、1B，2空、2A、2B5空、5A、5B，并每支试管加入1.8ml 0.25%的果胶溶液置于37C的恒温水浴

11、锅中预热5min。6、取离心好的上清液分别在其数字对应的A、B试管内加入0.2ml上清液，注意， 空白管不加。7、加好后精确计时30min，当时间到时，向每支空白管内分别加入对应序号的离 心管内的上清液，同时加入1ml40%的NaOH与3mlDNS试剂终止反应。8、将所有的试管取出再沸水浴5min。取出后流水冷却。9、向每一支试管内加入14ml蒸馏水并震荡使其混合均匀。10、用分光光度计在540nm的波长的光下以空白管为对照测定A,B管的反应液的吸光度，并计算出酶活，选出产酶最高的菌种作为以后条件优化的实验菌种。(五) 、果胶酶产生菌发酵产酶条件的优化：1、氮源的选择：(使用固体发酵)(1)

12、、配制固体发酵培养基3份并将氮源分别改为硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏并按 照1%的浓度替换发酵培养基中的蛋白胨；(2) 、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后接种5%的选择出的菌种；(3) 、在30C的恒温培养箱中培养48小时；(4) 、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内 烘干(温度不宜太高，否则会使酶失活)；(5) 、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍 后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清(注意做好标记)；(6) 、取3支离心管分别标记上“1 (硫酸铵)”、“2 (蛋白胨)”、“3 (牛肉膏)” 并加入上方对应氮源添加后发酵得到

13、的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min；(7) 取9支试管分别标记为“1空、1A、1B，2空、2A、2B，3空、3A、3B”。并分别加入1.8ml0.25%的果胶溶液。于37C的恒温水浴锅中预热5min；(8) 向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后的上清液(酶液)，然后 精确计时30min；(9) 向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶 液与3ml DNS试剂终止反应；(10) 、取出各管并沸水浴5min，取出后流水冷却并分别加入14ml蒸馏水后混匀;(11) 、以空白管对照用分光光度计测定540nm下的吸光度并计算酶活；(12) 、选出

14、最佳氮源。2、氮源浓度的优化：(1) 、配制固体发酵培养基5份并将氮源浓度分别改为0.5% (1)、1.0% (2)、1.5%(3) 、2%(4)、2.5%(5)替换发酵培养基中的蛋白胨；(2) 、于高压灭菌锅中灭菌40min，取出冷却后接种5%的选择出的菌种；(3) 、在30C的恒温培养箱中培养48小时；(4) 、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内 烘干(45C左右)；(5) 、各取出烘干的酶曲称取1g于一试管中并加入19ml缓冲液将其稀释20倍 后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清(注意做好标记)；(6) 、取 5 支离心管分别标记上“1 (0.5%)”、“

15、2 (1.0%)”、“3 (1.5%)”、“4 (2%)”、 “5 (2.5%)”并加入对应氮源浓度添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心5min (或者用纱布过滤)；(7) 取9支试管分别标记为“1空、1A、1B, 2空、2A、2B5空、5A、5B”。 并分别加入1.8ml0.25%的果胶溶液。于37C的恒温水浴锅中预热5min；(8) 向除了空白管以外的其他几支管加入0.2ml离心后制得的酶液，然后精确计 时 30min；(9) 向空白管内分别各加入0.2ml的酶液同时每只管个加入1ml 40%的NaOH溶 液与3ml DNS试剂终止反应；(10) 、取出各管并沸水浴5min，取出后流水冷却并分别加入14m