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1、实验九血清谷丙转氨酶的测定一、实验目的1. 掌握比色分析法测定血清谷丙转氨酶活性的原理；2. 熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的方法；3. 了解血清谷丙转氨酶测定的临床意义。二、原理血清谷丙转氨酶（S、G、P、T ）作用于丙氨酸及a一酮戊二酸，结果生 成谷氨酸与丙酮酸。丙酮酸与2, 4二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此物 在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以 表示酶的活性。GPTa一酮戊二酸+丙氨酸 谷氨酸+丙酮酸丙酮酸+2 .4一二硝基苯肼 丙酮酸二硝基苯腙（红棕色）三、操作15X25mm中试管4支，标号，按下表操作:-管号试剂（ml）标准管标准空白管测定管测定空
2、白管丙酮酸标准液（100ug/ml）0.1新鲜血清0.10.1底物液（在37C保温过）0.50.50.5磷酸盐缓冲液0.1前三管置于37C保温30分钟2.4二硝基苯肼0.50.50.50.5底物液0.5充分混合，置于37C保温20分钟0.4N氢氧化钠5.05.0.05.0静止10分钟后，选用520nm的单色光，以蒸馏水调零，测定各管光密度。四、计算本法所规定的谷丙转氨酶活性单位的定义是：1ml血清于37C与底物作用 30分钟，产生2.5ug丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。测定管光密度一测定空白管光密度11血清谷丙转氨酶= X 10 X X 标准管光密度一标准空白管光密度0.12.5测定管光密度
3、一测定空白管光密度= X40 （SGPT活性单位）标准管光密度一标准空白管光密度正常值：240单位/ml血清。注意：1. 2, 4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，a-酮戊二酸也能 与2, 4-二硝基苯肼作用而现色。此外，2, 4-二硝基苯肼本身也有类似的颜色， 因此空白管颜色较深，吸光度常在0.18左右。2. 可用小白鼠肝匀浆（20倍稀释）代替血清进行实验。3. 肝匀浆的制备：用右手抓住小白鼠的尾巴，另其头朝下，然后迅速置桌 上，立即用左手按住鼠的颈子右手猛拉老鼠尾巴，使颈椎卡断死亡。将肝脏取出， 放在滤纸上，用天平称重，放在研钵中，生理盐水5ml研磨，然后再加生理盐水， 配成1：
4、 19 （即20倍稀释）的肝匀浆，用双层纱布过滤，收集滤液备用，此液 每ml含G.P.T200单位。附：试剂的配制（1）1M/10磷酸盐缓冲液（PH=7.4）：取磷酸二氢钾2.69g，磷酸氢二钾13.97g 加水溶解后移至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，贮于冰箱中备用。（2）底物液（基质液）：取DL-丙氨酸1.79g，a一酮戊二酸29.2mg，先溶 于约50ml磷酸缓冲液中，然后以1NNaOH校至PH=7.4，再以磷酸盐缓冲液稀释 到100ml，加氯仿数滴防腐，贮存冰箱一般可用一个月（不生混浊，不生霉即可 用）。（3）丙酮酸标准液（100ug/ml）：准确称取己干燥至衡重的丙酮酸12.64mg， 置于100ml容量瓶中，以PH=7.4磷酸缓冲液稀释到刻度。此液必须临用前配制， 不能存放。（4）2，4-二硝基苯肼液（0.02%）:称取2, 4-二硝基苯肼20mg，溶于10N HCI10ml中，（或4N HCI125ml中），溶解后再加蒸馏水至100ml。
