项目九 凝集反应

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1、项目九 凝集反应一、直接凝集试验（Direct agglutination）（一）玻片凝集试验【实验原理】 天然的颗粒性抗原与相应抗体在适宜条件下反应，出现肉眼可见的凝集物，称为直接凝 集反应。玻片法属于定性试验，常用已知抗体直接检测未知的细胞性抗原，对抗原进行鉴定。【试剂和器材】1 待检标本OX19变形杆菌1824h琼脂斜面培养物。2. 试剂 OX19变形杆菌诊断血清（用时以生理盐水作适当稀释）、生理盐水。3器材 载玻片、接种环、滴管等。【步骤和方法】 1于洁净玻片一端加诊断血清1滴，另一端加生理盐水1滴作对照。2. 用接种环挑取OX19变形杆菌1824h琼脂斜面培养物，分别涂于生理盐水和诊

2、断血 清中，充分混匀。3室温下静置数分钟，观察结果。【结果判定】 生理盐水对照应不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。在诊断血清中，如混悬液由混浊变 澄清并出现肉眼可见的凝集小块为阳性结果；如与对照相同，则为阴性结果。【注意事项】 1玻片应洁净、干燥、中性，以防止和减少非特异性凝集。2每一待检菌均须作生理盐水对照，如对照凝集则表示细菌（粗糙型）发生自凝，试验 结果无效。3在载玻片两端涂布细菌时，应先在生理盐水中涂，然后在诊断血清中涂，以免将血 清带入生理盐水中。4试验后的细菌仍有传染性，应将载玻片及时放入消毒缸内。5. 鉴定ABO血型时，室温若低于10C，易出现冷凝集而造成假阳性结果。【方法评价】

3、此法操作简便，反应迅速，为定性试验，但敏感性较低。【临床意义】主要用于细菌菌种的鉴定和分型以及ABO血型的鉴定。（二）试管凝集试验【实验原理】 试管法直接凝集试验常用于半定量检测，是将已知的颗粒性抗原悬液定量地与一系列倍 比稀释的待检血清等量混合，静置一定时间后，根据各管的凝集程度，判断待检血清中抗体 的效价。【试剂和器材】1标本 用生理盐水1:10稀释的待检血清。2试剂 诊断菌液（伤寒沙门菌H或O菌液，10亿/ml）、生理盐水。3. 器材37C水浴箱、试管、1ml吸管、吸耳球等。【步骤和方法】 1取洁净试管8支，排列于试管架上，依次编号。2各管均加入 0.5ml 生理盐水。3吸取 1:10

4、稀释的待检血清 0.5ml 加入第 1 管；充分混匀后吸出 0.5ml 加入第 2 管， 混匀，从第 2 管吸出 0.5ml 加入第 3 管；同法依次稀释至第 7 管，混匀后从第 7 管吸出 0.5ml 弃去。第8 管不加血清作为生理盐水对照。至此，第 17管的血清稀释度为1:20、1:40、1:80、 1:160、1:320、1:640、1:1280。这种稀释方法称为连续倍比稀释法，是免疫学试验中常用的 一种稀释方法。4. 每管加诊断菌液0.5ml,此时每管内血清稀释度又增加1倍，分别为1:40、1:80、1:160、 1:320、 1:640、 1:1280、 1:2560。5. 各管摇匀

5、后置室温或37C1824h，观察结果。操作程序见表1-4。表 1-4 试管凝集试验操作程序试管号1 2 3 4 5 6 7 8生理盐水（ml）1:10待检血清 （ml）诊断菌液（ml）0.50.50.5 0.5哺去0.50.50.50.50.50.50.50.50.5血清终稀释度1:401:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 对照【结果判断】 判定凝集试验的结果，要有良好的光源和黑暗的背景。先不振摇，观察管底凝集物和上 清浊度。然后轻摇或用手指轻弹管壁使凝集物悬浮，观察凝集块的松软、大小、均匀度和悬 液浊度。1. 先观察盐水对照管，应无凝集现象。管底沉积呈圆形

6、、边缘整齐，轻摇则沉积菌分 散，均匀混浊。2. 再观察试验管，伤寒杆菌O抗原凝集物呈颗粒状，轻摇时不易升起和离散，往往粘 附于管底。 H 抗原凝集物呈棉絮状，沉于管底，轻摇易升起和离散。根据凝集的强弱程度， 可将试验结果划分为以下等级：“4”：很强，细菌全部凝集，管内液体澄清，可见管底有大片边缘不整的白色凝集物， 轻摇时可见有明显的颗粒、薄片或絮状。“3”：强，细菌大部分凝集，液体轻度混浊，管底有边缘不整的白色凝集物，轻摇时 可见较明显的颗粒、薄片或絮状。“2”：中等强度，细菌部分凝集，液体较混浊。 “”：弱，细菌仅少量凝集，液体混浊。“”：不凝集，液体混浊度及管底沉集物与对照管相同。3. 以

7、出现“2”凝集强度的血清最大稀释倍数作为待检血清的效价（滴度）。【注意事项】1. 抗原、抗体在比例适当时，才出现肉眼可见的凝集现象。如抗体浓度过高，则无凝 集物形成，出现前带现象。此时须加大抗体稀释度重新试验。2. 判断结果时，应在暗背景下透过强光观察。3. 注意温度、pH、电解质对试验结果的影响。4. 抗原、抗体加入后要充分振摇，以增加抗原抗体的接触。【方法评价】 本试验是一种经典的半定量凝集试验，操作简单，但敏感性不高。【临床意义】 本法主要检测血清中有无某种特异性抗体及其效价，以协助临床诊断或供流行病学调 查。常用的有诊断伤寒和副伤寒的Widal反应（肥达反应）、诊断斑疹伤寒、恙虫病等立

8、克次 体病的Weil-Felix反应（外-斐氏反应）、诊断布氏菌病的Wright反应（瑞特反应）。【附】 诊断菌液的制备1. “H”型伤寒沙门菌菌液的制备将伤寒沙门菌（H901株）或甲、乙型副伤寒沙门菌标准菌株接种于柯氏瓶培养基上，37C 培养24h,用10ml含0.4%甲醛的生理盐水将菌苔洗下，放入有玻璃珠的无菌烧瓶中充分振 摇，使细菌充分分散，置4C冰箱中35日以杀菌。通过无菌试验证实细菌确已被杀死，即 用0.2%的甲醛盐水稀释成10亿/ml的浓度。置4C冰箱备用。2. “O”型伤寒沙门菌菌液的制备将标准菌株（O901株）以上法培养，用0.5%石炭酸盐水将菌苔洗下，置37C温箱过夜或 室温

9、中47日以杀菌。经检查无菌生长时，用0.25%石炭酸盐水稀释成10亿/ml浓度。置4C 冰箱备用。3. 菌液浓度测定用麦克法伦特（McFarland ）标准比浊管比浊的方法来测定，见免疫血清的制备。【思考题】1. 与沉淀反应相比凝集试验有何特点？2. 决定血清凝集效价高低的因素是什么？3. 引起非特异性凝集的因素有哪些？二、间接凝集试验（Indirect agglutination）将可溶性抗原（或抗体）吸附于一种与免疫无关的、适当大小的载体微粒表面，再与相应 抗体（或可溶性抗原）在适宜条件下相互作用，经一定时间出现肉眼可见的凝集现象，这种方 法称为间接凝集试验，又称被动凝集试验。 如将抗原吸

10、附于载体微粒表面以检测抗体，称 为（正向）间接凝集试验；如将抗体吸附于载体微粒表面以检测抗原，则称为反向间接凝集试 验。实验室常用的载体有红细胞、胶乳颗粒、活性炭、SPA菌体等，其中以红细胞为载体的 间接凝集试验称为间接或反向间接血凝试验。（一）间接血凝试验方法一【实验原理】 新鲜红细胞可直接吸附多糖类抗原，用已知多糖类抗原致敏红细胞，检测标本中相应抗 体，通过观测红细胞凝集现象，即可判断标本中有无相应抗体及其含量。【试剂和器材】1标本 待检血清、伤寒沙门菌o901兔免疫血清。2试剂 伤寒沙门菌O901、2%新鲜SRBC悬液、pH7.2 0.15mol /L PBS、生理盐水。3. 器材37

11、C水浴箱、试管、吸管等。【步骤和方法】1. 伤寒沙门菌o抗原溶液的制备 将伤寒沙门菌o901接种于普通琼脂斜面培养基，置 37C培养1824h，用无菌生理盐水洗下菌苔，配成100亿/ml菌悬液，置100C水浴2h， 3500r/min离心30min,吸取上清液，分装在无菌三角烧瓶中，置4C冰箱备用。2. 致敏SRBC的制备 取适量伤寒沙门菌O抗原溶液与2%新鲜SRBC悬液等量混合， 置37C水浴箱2h（每隔15min振荡1次），取出后离心，用生理盐水洗涤3次（每次2000r/min， 离心10min），最后用PBS配制成1%的致敏SRBC悬液。3. 间接血凝试验 按表1-5将待检血清用PBS作

12、倍比稀释，同时设致敏血球、阳性对照；然后各管加0.5ml 1%致敏SRBC悬液，混匀，置37C水浴2h,观察结果。表 1-5 间接血凝试验操作程序试管号12PBS(ml)0.9 -I 0-5待检血清 （ml）0.10.5090抗血清（ml）致敏 SRBC(ml)0.50.5血清终稀释度1:201:400.50.53456780.50.50.50.50.5.50.5.50.5弃去0.50.50.50.50.50.50.50.51:80 1:160 1:320 1:640 1:12800.5【结果判定】1红细胞的凝集强度可根据下面的标准划分为不同等级； “4”：红细胞形成片状凝集，均匀布满管底，凝

13、集边缘不整齐或折叠。 “3”：红细胞形成片状凝集，有卷边或缺口，面积略小于“4”。 “2”：红细胞形成片状凝集，面积较小，边缘较松散。“”：红细胞沉积于管底，周围有散在的少量凝集。“”：红细胞沉积于管底呈小圆点，边缘清晰整齐。2效价判定 致敏血球对照管呈“”，测定管以出现“2”凝集强度的血清最高稀 释倍数作为该血清的凝集效价。【注意事项】1. 试验用红细胞为SRBC或人“O”型红细胞，被直接致敏的新鲜红细胞不宜长期保 存。2用动物红细胞作载体，为防止非特异性凝集的出现，临床待检标本（如血清、脑脊液 等）应先通过吸收法去除非特异性凝集素。3试验时应同时作阳性、阴性和致敏血球对照，必要时可作间接血

14、凝抑制试验，以确 保结果的准确性。【方法评价】 此法简便、快速、成本低廉，敏感性较沉淀反应高，是一个半定量试验；但非特异性凝 集较严重，试验时应同时设立阳性、阴性和致敏血球对照，及配合间接血凝抑制试验确定。【临床意义】本试验举例是以教学角度考虑而设计的，因伤寒沙门菌O抗原容易制备，实际工作中 并不常用。它主要用于传染病抗体、自身抗体、变态反应性抗体的检测。【附】 非特异性凝集素吸收去除法1. 取0.2ml 56C灭活30min的血清，加入生理盐水0.6ml。2. 加入0.2ml 10%红细胞悬液（用pH7.2 PBS洗涤3次，每次600r/min离心5min,再 600r/min离心10min

15、,按压积配制成10%悬液）。3. 混合后置室温10min，离心，留取上清液，该血清为1:5经吸收的血清。 （二）间接血凝试验方法二【实验原理】 鞣化（或醛化）红细胞可牢固吸附蛋白质类抗原，用已知蛋白质抗原致敏红细胞，检测标 本中相应抗体，通过观测红细胞凝集现象，可以判断标本中有无相应抗体及其效价。【试剂和器材】1. 标本 待检血清（抗人丙种球蛋白）。2. 1%鞣化SRBC悬液、1%鞣化致敏SRBC悬液。3pH7.2 0.15mol/L PBS。4pH6.4 0.15mol/L PBS。5. 1%正常兔血清（NRS）将NRS 56C灭活30min,用pH6.4 PBS配制。该液不应与 鞣化或致敏的SRBC反应，否则应废弃，选择无反应的NRS重新配制。6. 器材温箱、微量振荡器、8x12孔“V”型孔微量反应板、微量加样器、50卩1微量 稀释棒、小吸头等。【步骤和方法】1. 将待检血清56C灭活30min。2. 在“