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1、RNA疗法：超越RNA干扰和翻译寡糖核酸摘要：在这里，我们讨论三个以RNA为基础的治疗技术，利用各种寡糖核苷酸在一个特定 序列下结合RNA进行碱基配对的效果和行动的不同机制。RNA干扰与反义寡糖核苷 酸下调基因表达，诱导依赖酶有针对性地退化RNA的表达，空间阻塞的寡核苷酸阻 止细胞器访问mRNA前体和其没有讲解的RNA。通过这一机制，空间阻塞的寡核苷 酸可以重新定向剪切，修复有缺陷的RNA，还原蛋白质的合成或下调基因的表达。此 外，它们还可以进行广泛的化学修改，用以获取更多类似药物的性质。阻塞的 RNA 寡核苷酸还有恢复基因功能的能力，使它们能最好地与遗传疾病的治疗配合。并从临 床治疗杜氏肌营
2、养不良症试验取得积极成果，这项技术已经接近实现并有良好临床应 用前景。大多数目前市场上销售的药物是小分子，如酶和受体靶蛋白，它们代表总蛋白的相当小的子 集。相比之下，寡核苷酸大分子这一目标前体mRNA表达之前，被翻译成蛋白质的遗传信 息。由于基因编码所有细胞的蛋白质，寡核苷酸定位基因可能被证明是有效的。目标是针对 不属于现有药物可治疗的疾病。例如，遗传性疾病-杜氏肌营养不良症（DMD ）和脊髓性 肌萎缩症（SMA）的（下面讨论）等疾病。这项技术包括以下三种方法，利用核苷酸:RNA 干扰（RNAi），反义寡核苷酸和空间位阻，阻断寡核苷酸。这三种方式涉及的互补结合，通 过基本的RNA的寡核苷酸配对
3、，因此所有三种方法本质上都是通过反义机制运作。然而， 它们在其下游行动和产生功能性结果的机制却大不相同。RNA 干扰反义寡核苷酸在这里我们就只是简单地讨论，因为它们现在已经应用十分广泛。 它们调节基因表达的诱导酶降解目标mRNA并去除致病基因产物，如癌基因或促炎性细胞 因子。而作为细胞酶就需要认识到这些反义化合物，它们只能在有限的程度进行化学修改， 所以这限制了我们加强他们药理性质的能力。反义化合物，通过阻断访问细胞器的RNA去 调节RNA的功能，所以不会导致靶RNA的降解，这也是是本研究的主要焦点。这一行动 的不同模式导致了一定的结果，例如修理有缺陷的RNA或一种新蛋白，而使用RNA干扰 或
4、反义寡核苷酸就不可能实现。此外，因为非阻塞RNA寡核苷酸的活动不需要利用细胞酶， 并且它们可以应用更广泛的化学修饰来改善它们类似药物的性质。细胞少量摄入RNA干扰，反义寡核苷酸和空间阻断核苷酸是其作为疗法使用的一个主要障 碍。这也是抗病毒药物fomivirsen3是目前唯一被批准的反义药物（虽然药物2004年由于 药品市场减少被中断）的主要原因。在本次研究中强调化学的最新进展即运用这三种技术的 不同特征，改善反义寡核苷酸在细胞内传递。核酸适配体，这是比寡核苷酸结构更加复杂以 RNA为基础的药物，并能直接与蛋白质相互作用，而不是与互补的RNA作用，但在本文中 不作涉及。降解靶mRNA的寡核苷酸R
5、NA干扰首次证实是其在秀丽线虫外源性的传递，双链RNA（dsRNA）通过诱导同源mRNA 的降解有效地抑制一个基因（编码肌丝蛋白质）的表达。介导基因沉默的机制涉及双链RNA 降解成小分子干扰核糖核酸（siRNAs）21-22个核苷酸长度并与多蛋白RNA诱导的沉默 复合体（RISC）交互的双链RNA片段。在RISC中，小分子干扰核糖核酸得到释放，正义 链被丢弃，并且反义或导链结合到mRNA。当其目标是完全互补的siRNA，内切酶Argonaute 蛋白2 - RISC的一个组成部分，能从mRNA反义链5端切割10和11个核苷酸下游。尽管RNA干扰最初无法在哺乳动物细胞中被检测到。但在后来的研究表
6、明，这些细胞中 缺乏能力把双链RNA切割为siRNA。当合成的siRNA被摄入到体外培养的人体细胞，其可 以进入RISC并降解目标mRNA。这一发现导致siRNA的相关研究迅速增加。在2002 年, 也就是siRNA发现一整年后，siRNA的期刊查询最终被234次引用；在2002-2010年期间 它更是被33009次引用，其中7241 次是从2010年起的。值得注意的是，活体实验第一个 成功的早在2003年就开展了:在暴发性肝炎得小鼠模型中用裸siRNA抑制FAS的mRNA 表达。在RNAi研究数量增加也是公司创办的结果，如Alnylam制药及siRNA治疗作为一 种很有前途的治疗平台专注于发
7、展siRNA的结果。寡核苷酸诱导基因表达下调的机制： 小分子干扰核糖核酸（siRNA）：合成的双链siRNA与RNA干扰通路组成部分，Dicer 酶,Argo naute蛋白2（AGO2）以及其他蛋白质络合，形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）。RISC通过解开siRNA的导链结合目标mRNA，使得AGO2降解RNA。RISC结合的 siRNA也可以结合非预期的不匹配mRNA，导致显着的脱靶效应（见正文）。 反义gapmer寡核苷酸：其通常都有一个有侧翼的硫代骨干，侧翼通常是被2-0-甲氧基 乙基（2-MOE）或2-O-甲基（2-OME）残留物（图中以红色突出显示）修饰的。侧翼 的修饰增加了
8、反义寡核苷酸（ASO）降解的阻力，增强与目标mRNA的结合。侧翼是否 修改在gapmer-mRNA中由降解双螺旋mRNA的核糖核酸酶H （RNase H）的有无来进 行确认。 抑制翻译的寡核苷酸（TSOs）： phosphorodiamidate吗琳低聚物（PMOS）和其衍生物， 以及2-MOE或2-OME残基完全取代的寡核苷酸都不能检测出RISC或RNase H，因此 也就不会导致 RNA 的降解。然而，它们通过核糖体与 mRNA 的空间位阻以及抑制蛋白 质的翻译导致了基因表达的下调。 外部引导序列（EGSs）和RNase P.:一种肽类结合的PMO （PPMO）设计用于目标细 菌mRNA杂
9、交形成茎环结构等，并由此产生双螺旋的tRNA类似物。在细菌中，一个经加 工的tRNA核酶一核糖核酸酶P可以识别这种结构并酶切mRNA。寡核苷酸化学： 所有寡核苷酸都是带负电荷的：硫代（PS）的骨干以及2-0 -甲氧基乙基（2-M0E）和 2-0-甲基（2-0ME）取代基可以提高抗降解的能力并促进蛋白结合靶RNA。锁核酸（LNA） 的修改显着提高寡核苷酸与目标mRNA的结合（见顶部面板）。在phosphorodiamidate吗 啉低聚物（PMOS ）中，核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）被吗啉环替代，硫代 磷酸以及磷酸双酯键（RNA）的群体被带电phosphorodiamidate群体
10、替代，产生了一种十 分耐降解的中性化合物（见底部面板）。在带正电的PMOs中的带正电的哌嗪残基（PMOplus） 以及在结合肽的PMOs（PPMOs）中带正电的富含精氨酸的多肽，能够显着提高细胞内摄 取低聚物。寡核苷酸诱导的调控基因表达的机制： 外显子跳跃剪接转换的的寡核苷酸（SSOs）： 一种化学修饰，阻塞的RNA寡核苷酸定位 到在mRNA前体中的剪接位点以及内部外显子剪接的增强剂（ESE），防止外显子上的剪 接体的正确组装以及重定向到另一个通路的剪接，并诱导目标外显子的跳跃。这种交替剪 接的的mRNA可能会编码具有良好的性能新型蛋白质，且在杜氏肌营养不良症的情况下 若外显子跳跃恢复读码框则
11、其可恢复翻译。另外，它可能会改变剪接变异体的替代平衡。 而且这些降解目标mRNA的成果是不能依靠反义寡核苷酸以及小分子干扰RNA来实现的。 外显子由SSOs保留：一些外显子与mRNA之间剪接不佳是因为它们含有外显子剪接消 音器（ESS）元素。SSO旨在阻断ESS与该元素在剪接中的角色之间的干扰，及促进外 显子的包容性，在遗传疾病脊髓性肌萎缩的情况下已经被证明。 正确的剪接的恢复和通过SSOs进行的RNA维修：一个内含子突变可能会创建和/或激活 异常剪接位点，从而导致内含子片段被纳入到剪接的mRNA里，在本质上是创建了一个 伪外显子并干扰了读码框的翻译。定位异常剪接元素的SSO还原了正确的拼接并
12、允许功 能齐全蛋白质的正确翻译。 三重重复序列上剪接因子的位移：一个在营养不良性肌强直症蛋白激酶DMPK） mRNA 前体中扩展的三重重复序列（CUGCUGCUG）吸引因为类似盲肌的蛋白质（MBNLs）而 被知道的剪接因素，从核质外滴定它们。因此，体内代谢和其他几个mRNA前体并没有 被正确加工，从而避免一些蛋白质的翻译以及神经肌肉障碍的强直性肌营养不良症的成 因。一种改进的空间阻塞寡核苷酸取代了 MBNL,允许其参加适当的mRNA拼接及恢复 受影响肌肉的功能。前景仅有的两个被批准的核酸类药物已经达到了市场和局部体内注射的要求。这两个药物一个是 反义寡核苷酸fomivirsen, 个是RNA适
13、配体pegaptanib（Macugen药物;辉瑞/ Eyetech 制药）第二个药物在这里并没有讨论。因为这些大极性分子没有遵循利平斯基的规则：经验 规则指出，除等特点，有效的药物总是有分子量低于 500 达，在极性和非极性溶剂可溶性 相当，所以它被认为基于寡核苷酸药物对系统无法生效。虽然寡核苷酸显然不符合这些标准， 基于本文上述的一些观点在我们看来这一领域已经处在成功边缘。在现在增强细胞吸收寡核 苷酸的新型化学物质尤其被看好。同样，以RNA为基础的疗法潜力很大，迄今已经对影响 现有药物无法治疗的疾病有一定的作用。所以这些化合物当然值得我们努力去从中得到有效 的药物。有一个与单克隆抗体的比较很有启发性。这类不遵循利平斯基的规则的寡核苷酸现在全球市 场已经超过40 亿元，并被用来治疗严重慢性疾病，如癌症，多发性硬化症和类风湿关节炎。 特异性识别抗原的单克隆抗体最早产生于1975 （注释94）, 1986年FDA批准了一个单一 的单克隆抗体然后在此大约10年后其大量流入了市场。我们相信，寡核苷酸和RNA为基 础的疗法很有潜力并能短时间内获得很大的进展。
