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1、利多卡因通过抑制NF-B的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤徐州医学院附属医院麻醉科，江苏 徐州 221002封光 刘苏 王光磊 刘功俭* 摘要 目的：探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制。方法： SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-
2、B和胞浆IB的表达，ELISA检测血清TNF-及IL-6的水平，观察大鼠肺组织病理变化。结果：大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织核内NF-B的表达明显增多，血清TNF-及IL-6的水平明显升高，胞浆IB表达显著减少，病理切片示肺组织结构破坏严重。应用利多卡因后，与LPS组相比，核内NF-B的表达明显减少，胞浆中IB表达显著增加，血清中TNF-及IL-6的水平也明显降低，肺组织结构的破坏有明显减轻。结论：应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-B的活化和TNF-、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-B的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-B活化的抑制可能与其抑制IB的
3、降解有关。SummaryBackground and Objectives: Lidocaine has been reported to attenuate the inflammatory response in addition to its anesthetic activity, but the mechanisms are poorly understood. The objective of this study is to determine if Lidocaine prior to endotoxemia diminishes pulmonary dysfunction b
4、y blocking the NF-kappa B activation. Methods: Rats were assigned to: 1) control (0.9% sodium chloride); 2) LPS; 3) LPS +lido1mg/kg; 4) LPS +lido2mg/kg; 5) LPS +lido4mg/kg. LPS and LPS+lido4mg/kg groups were subjected to 1h、3h、6h and 12h time point. To investigate the activation of NF-kappa B, the e
5、xpression of NF-kappa B in the nuclear and I kappa B alpha in the cytosol were analyzed by western blot. The concentration of TNF-alpha and IL-6 in serum was detected by ELISA. The pathologic changes of lung were observed using HE staining. Results: After i.p. injection of LPS, the expression of NF-
6、kappa B in the nuclear extracts was significantly increased and I kappa B alpha in the cytosol extracts was markedly decreased. The concentration of TNF-alpha and IL-6 in serum was increased. Pathological examination showed that the normal structure of lung was destroyed badly. However Lidocaine rev
7、ersed above results. Conclusion: Lidocaine attenuates LPS-induced lung injury via mechanisms involving inhibiting NF-kappa B activation and cytokines release, which implies Lidocaine may be as a potential anti-inflammatory agent in endotoxemia.利多卡因通过抑制NF-B的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤摘要 目的：探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机
8、制。方法： SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-B和胞浆IB的表达，ELISA检测血清TNF-及IL-6的水平，观察大鼠肺组织病理变化。结果：大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织核内NF-B的表达明显增多，血清TNF-及IL-6的水平明显升高，胞浆
9、IB表达显著减少，病理切片示肺组织结构破坏严重。应用利多卡因后，与LPS组相比，核内NF-B的表达明显减少，胞浆中IB表达显著增加，血清中TNF-及IL-6的水平也明显降低，肺组织结构的破坏有明显减轻。结论：应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-B的活化和TNF-、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-B的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-B活化的抑制可能与其抑制IB的降解有关。 关键词：利多卡因；核因子-B；肿瘤坏死因子-；白细胞介素-6；内毒素；肺损伤急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由严重感染、创伤和体克等多种病因所致的弥漫性肺实质
10、损伤，其在分子水平上表现为众多促炎性细胞因子、粘附分子的过度表达，伴有多种炎症介质的产生。上述炎症形成级联反应，导致肺组织广泛损害，并累及诸多肺外器官，其中，核因子-B（NF-B）在调控炎症介质的基因表达上起着关键作用。多种炎症介质基因的启动子和增强子中含有B位点，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）等。活化的NF-B可调控上述介质基因的表达。最近的研究证明酰胺类局麻药利多卡因有着显著的抗炎特性1,2,3，因此本实验建立大鼠内毒素性肺损伤模型，探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制4-6。 材料与方法实验动物及主要试剂：雄性SD大鼠（
11、由徐州医学院实验动物中心提供）250300g，LPS（E. Coli 0127:B8）购自sigma公司，NF-B p65 多克隆抗体， IB（NF-B阻遏蛋白）多克隆抗体（Santa Cruz公司），TNF-及IL-6酶联免疫（ELISA）试剂盒（美国R&D公司），利多卡因（第二军医大学朝晖制药厂），HE染液（江苏海门碧云天公司）。SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4
12、mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。参照Sabrina M. Heidemann的实验7，采用腹腔注射LPS 8mg/kg（5mg/ml）制作内毒素性肺损伤模型，control组注射同体积的生理盐水。LPS +lido组在注射腹腔注射内毒素前10min，尾静脉注射利多卡因4mg/kg（10mg/ml），而LPS组和control组给予同体积的生理盐水。按分组规定的时间点，10水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，取出肺组织。右肺下叶，-80冻存，用于Western印迹分析，左肺上叶做石蜡切片用于HE染色病理切片。1、肺组织石蜡切片的制备：各
13、组实验大鼠分别在相应的时间点，采用 10水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，经4多聚甲醛心脏灌注固定后，取左肺上叶，浸泡固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成4 mm厚的连续石蜡切片。2、蛋白质印迹(Western印迹)检测：从液氮中取出肺组织，加1.5 ml Buffer A (含10 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 30 mM b-phosphoglycerol, 1 mM Na3VO4, 1 mM benzamidine and enzym
14、e inhibitors: 0.5 mM PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin, 10 g/ml pepstatin A and 1 mM PNPP)。用电动匀浆器高速匀浆（10秒6次），加入10%的NP-40 90 ml，剧烈振荡30 S，800 g15 min离心，上清液为胞浆部分。后在沉淀物中加入500 ml Buffer B (20 mM HEPES, pH 7.9, 20% glycerol, 0.42 M NaCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT and enzyme inh
15、ibitors: 0.5 mM PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin, 10 g/ml pepstatin A and 1 mM PNPP)，4转摇30min，12,000 g15 min离心，取上清为胞核成分，胞浆和胞核测蛋白后分装，置-80冰箱待用。蛋白含量测定按改良Lowry法8，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。按Gu等方法9作稍微改动，等量蛋白样品经10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以干转法电转移至NC膜上，转移缓冲液为25 mM Tris, 192 mM甘氨酸，20%(v/v)甲醇, pH8.3，转移条件为稳流：电流大小(A)=膜面积(cm2)2.5，时间30min。转移后的NC膜经3% BSA室温封闭3 h后加入适当稀释的一抗，室温4h或4过夜。用缓冲液（10 mM Tris, pH7.4，0.1 mol/L NaCl, 0.1%Tween-20）洗膜三遍，加入相应酶标二抗，37反应2h，缓冲液洗膜三遍。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。结果以UVP图像分析仪（Gene Company）分析处理。3.酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中TNF-和IL-6：收集血液标本，取出试剂盒平衡至室温（2025），浓缩洗涤液用双蒸水稀释1倍（至500ml），加入10l标准品，10l血浆于
