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1、2017年度的诺贝尔生理或医学奖颁给了3位美国科学家杰弗里霍尔JeffreyC.Hall),迈克尔罗斯巴什(MichaelRosbash)和迈克尔扬(MichaelW.Young)以表彰他们在发现果蝇(Drosophilamelanogaster)生物钟基因及分子调控机制过程中的重要贡献。地球上所有的生物，由于受到地球自转、昼夜更替产生近约24小时的周期性调节和生理活动，称为昼夜节律。这个周期性调节是内源性的、写在基因组里的。早在1729年，法国天文学家JeanJacquesdOrtousdeMairan就完成了第一有文字记载的生物节律实验：在自然条件下含羞草(Mimosapudica)的羽状
2、复叶在白天打开在夜间向下合拢，在持续黑暗条件下含羞草叶片依然保持与昼夜一致的节律性运动.。该结果证明，在恒定条件下依然维持周期节律运转的调控来自机体内部的作用机制，即内源的生物钟(internalbiologicalclock)。此后其他科学家也陆续报道了有关昼夜节律方面的研究。后随着分子生物学和分子遗传学的快速发展，科学家们开启了对生物节律分子调控机制的探索。他们早期的工作主要是利用遗传学手段在多个物种中筛选昼夜节律缺陷的突变体，并对突变基因进行遗传学定位分析，来鉴定调控昼夜节律的生物钟基因。1971年，美国遗传学家本泽尔SeymourBenzer和康诺普卡RonKonopka在加州理工学院
3、以果蝇为实验材料，利用化学诱变的方法筛选得到了第一个生物钟基因突变体。利用了两个十分巧妙的实验设计：一是将诱变的雄性果蝇与果蝇遗传学特有的并联X染色体(attached-X)的雌性果蝇进行交配，确保F1代雄性果蝇携带的X染色体来自父本，并可以以F1代雌性果蝇作为内部对照；可以快速检测X染色体的突变。二是借助野生型果蝇成虫的羽化行为主要集中在一天中的黎明时段这一特性(属于生物钟调控的果蝇的周期节律性状之一)，筛选在下午或夜间时段羽化的果蝇，可极大提高突变体筛选效率。他们最终获得了3个不同的昼夜节律表型缺陷的突变品系一er0(节律丧失)perS(节律周期缩短)、perL(节律周期延长)；进一步的遗
4、传定位分析和顺反位置效应的互补测验结果显示，这3种不同的节律缺陷的表型源自果蝇同一个基因的突变，并将该基因命名为period(per)。本泽尔等人的工作并没有能够进一步解释节律基因到底是如何影响昼夜节律的，这一问题的答案在1980年代逐步浮出水面。1984年,美国洛克菲勒大学的MichaelW.Young和ThaddeusA.Bargiello在克隆per基因时发现一段约7.1kb的DNA序列与果蝇的生物节律相关，其转录一段4.5kb的mRNA；他们利用P-element介导的基因插入技术(一种可以将基因片段插入果蝇基因组的转座子)，将包含的7.1-kb片段插入卡内基20中，形成质粒pCP1进
5、行转化实验，将这段基因导入无节律的突变体果蝇per0，对其羽化行为和自发活动进行检测，发现突变体果蝇的节律性可以得到恢复，因此他们认为这段4.5kb的mRNA对应的基因就是per基因。在这项研究中，Bargiello等构建的重组质粒包含果蝇的眼色基因一野生型玫瑰红基因(ry+)，因此可以通过果蝇的眼色确定其是否为转基因株系。同年，来自美国布兰迪斯大学的JeffreyC.Hall和MichaelRosbash研究团队利用显微切除技术获得了X染色体的3B1-2区段并对其进行了分子图谱分析。他们通过敲除果蝇per位点附近的DNA区段得到了相应的突变体果蝇，对其生理及行为节律性进行分析，将per基因定
6、位于Df（1）K95突变体断点的右侧和Df（1）w-64d突变体断点的左侧，全长约15kb。其中一断点TJC43似乎是per区域的中心,这个断点导致了异常的生物节律。也导致了某些低于正常水平的转录。我们决定集中研究包括TJC43断裂点或其附近的DNA片段。用两个DNA片段14.6kb和8.0kb的片段（来自于穿过TJC43断点的per区域的部分，其中一个8.0kb的片段是另一个DNA片段的子集。）进行转化，拯救了per01导致的运动行为的节律异常。除14.6和8.0kb片段外，per区域的子片段不能挽救突变的行为表型。为进一步确定per基因的具体位置，他们对此段DNA转录的mRNA进行了分析，
7、发现per位点附近基因组序列的不同区段能转录多种大小、功能不同的mRNA，其中0.9kb的mRNA在per突变体中的表达都降低了；通过在不同时间段提取果蝇细胞内的mRNA，发现这段0.9kb的mRNA在夜间的表达丰度要明显低于白天，所以他们当时就认为这段0.9kb的mRNA所对应的DNA就是per基因。显然，Hall团队得到了与MichaelW.Young不一样的结果，而之后他们也通过P-element介导的基因插入技术进行了表型恢复实验，并对果蝇的自发活动以及雄蝇求偶歌的节律性行为进行研究，最终确定4.5kb的mRNA对应的基因是per基因。综上，果蝇per成为第一个克隆的生物钟基因，开启了
8、对生物钟分子调控机制的研究。1988年，JeffreyC.Hall实验室开始寻找per基因产物的高效特异性抗体，希望通过抗体来定位per基因在细胞中的表达，以此标记出果蝇生物钟核心振荡器的位置。他们以per序列合成的小肽为免疫原，制备了针对周期基因产物的多克隆抗体。用于产生多克隆抗体的四种肽在per序列中的位置如图。免疫沉淀实验表明，抗肽C、D和S的抗体沉淀了35s-标记的per蛋白质。免疫前血清或抗肽A抗体均未检测到特异性沉淀。Westernblot实验也得到了类似的结果。当结合抗肽D和S的抗体时，结合到体外翻译的per蛋白的强度最强，但也可以单独用任一抗体检测到。两种抗体的特异性染色模式相
9、似，但抗s抗体的特异性更强。用抗S肽抗体在夜间检测诱捕野生型果蝇per蛋白在果蝇中的特异性表达。未检测到与前免疫血清或肽A或肽C抗体的结合。研究结果表明per基因的表达产物（PER蛋白质）主要位于果蝇眼部的感光细胞、前脑以及果蝇脑部枕叶（类似于哺乳动物大脑的枕叶）。视觉系统中per特定染色的强度被发现是振荡的，在午夜达到峰值，定义了一个自由运行的昼夜节律。为理解这种昼夜周期的蛋白质浓度起伏的产生与维持，1990年，MichaelRosbash实验室发现perRNA的水平存在一个潜在的振荡。而以前观察到PER蛋白的水平也经历了昼夜振荡，他们观察提出per基因的表达受到一种负反馈调控，PER蛋白的
10、周期性表达依赖于per基因所编码的mRNA的周期性表达，而PER蛋白又可以通过负反馈环调控per基因所编码的mRNA的表达，因而持续而周期性地调节了自身的水平。但是当时并不知道这种调控出现在转录水平或是转录后水平，同样也不能确定这种调控是直接的还是间接的。为了了解PER是如何影响昼夜节律的，确定其亚细胞位置是很重要的。为此，1992年,MichaelRosbash实验室报告了分别使用多克隆抗per抗体或抗B-gal抗体对野生型果蝇和per-B-半乳糖苷酶（B-gal）融合基因转基因的免疫电镜分析结果。发现大多数PER抗原和融合基因产物位于细胞核内，表明PER蛋白是定位在细胞核内影响生物节律的。
11、PER蛋白是在细胞质中被翻译的，它又是如何在细胞核中起作用的呢？1994年，MichaelW.Young实验室通过P-element介导的基因插入技术，筛选出了影响生物节律的新突变体果蝇，这种突变体果蝇的羽化和活动都失去了节律性，他们把这突变体对应的野生型基因称为timeless基因（简称tim）。Vosshal等发现tim影响了per基因编码的mRNA的节律性振荡，在tim突变体中，PER蛋白在核中的定位受到抑制。同年，结合已有研究成果，AmitaSehgal与MichaelW.Young提出了果蝇的生物钟调控理论模型：per和tim表达的蛋白质达到峰值时会在细胞质内结合，结合产物积累到定数
12、量的时候进入细胞核，并且同时抑制tim与per基因的转录；当抑制强度最大的时候，tim与per基因所编码的mRNA表达水平降到最低；如此，两种蛋白的表达量相应降低，结合产物也就减少，基因的抑制作用被解除，重新开始表达，直到第二次达到峰值。研究也证明，在没有TIM蛋白表达的果蝇中，PER蛋白会发生持续性积累，并且无法入核。1996年，AmitaSehgal实验室发现TIM蛋白可以被光降解，在进入光照条件（ZT0）之后PER-TIM蛋白复合体的数量很快地被下调。上述研究成果阐述出果蝇PER蛋白的表达可调控节律的产生，但内源节律性振荡的周期长度（变化频率）的机制尚未被揭示。1998年，Michael
13、W.Young实验室又发现了一个新的生物钟基因doubletime，其表达产物DBT蛋白（哺乳动物CKI的同源蛋白）会使PER蛋白保持磷酸化状态，增强PER蛋白的稳定性，使PER蛋白组成性的积累，doubletime（dbt），这个基因可以编码一种DBT蛋白激酶，并通过这个激酶使得PER蛋白上的特定丝氨酸残基磷酸化，后果就是使得细胞认为这个蛋白要被降解了。然而当PER与TIM结合之后，DBT激酶便无法磷酸化PER了。这一机制的发现,进一步解释了为什么PER蛋白的振荡周期会稳定在24h左右，完善了per/tim的调控环路。随着一个个调控基因的发现和研究，驱动生物钟的内在机理也逐渐明朗。三位获奖者的发现建立了关键的生物钟机制原理。在接下来许多年里，生物钟机制的其他分子结构得到了阐释，解释了该机制的稳定性和功能。
