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1、8期 罗 利等：川楝素半抗原设计及其抗体制备2335川楝素半抗原设计及其抗体制备罗 利1，张 静1，刘 媛3，余向阳3，马志卿1，2，冯俊涛1，2，刘贤进3，张 兴1，2（1西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，陕西杨凌 712100；2陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西杨凌 712100；3 江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究中心，南京 210014）摘要：【目的】获得抗川楝素的高灵敏度，高特异性多克隆抗体，建立川楝素的间接竞争酶免疫测定（IC-ELISA）方法。【方法】采用酯化反应合成川楝素的半抗原并经HRMS，NMR及IR鉴定；用混合酸酐法和活化酯法分别合成人工免疫抗原与包被抗原
2、；通过免疫动物获得多克隆抗体。【结果】合成了琥珀酸单酰川楝素（TS）和戊二酸单酰川楝素（TG）2种半抗原，与载体蛋白BSA和OVA分别偶联制备了2种免疫原TS-BSA和TG-BSA，及2种包被原TS-OVA和TG-OVA。免疫后获得的2种抗体效价达6.4104和3.2105。经4种不同包被原抗体组合优化，以（TS-Ab，TG-OVA）组合建立的川楝素IC-ELISA检测方法，线性检测范围为0.01100 gml-1，检测限达0.03 gml-1，抑制中浓度为1.52 gml-1；以（TG-Ab，TG-OVA）组合建立的方法，线性检测范围为0.1100 gml-1，检测限达0.11 gml-1，
3、抑制中浓度为3.49 gml-1。水样中基于（TS-Ab，TG-OVA）组合的川楝素平均回收率为82.4%106.0%，精密度为1.1%14.3%。【结论】通过川楝素半抗原的合理设计，获得了高效价的抗川楝素多克隆抗体，建立了快速有效的川楝素IC-ELISA检测方法。关键词：川楝素；半抗原；多克隆抗体；ELISAHaptens Design and Production of Antibodies Against ToosendaninLUO Li1, ZHANG Jing1, LIU Yuan3, YU Xiang-yang3, MA Zhi-qing1,2, FENG Jun-tao1,2,
4、 LIU Xian-jin3, ZHANG Xing1,2(1Research and Development Center of Biorational Pesticides, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi; 2Shaanxi Engineering and Technology Center of Biopesticides, Yangling 712100, Shaanxi; 3Food Safety Research and Inspection Center, Jian
5、gsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014)Abstract:【Objective】The aims the experiment were to produce the polyclonal antibodies against toosendanin, and establish an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (IC-ELISA). 【Method】The haptens were synthesized by the reaction of
6、toosendanin with succinate and glutarate, respectively, and characterized by HRMS, NMR and IR. Artificial immunogens and coating antigens were prepared separately with the mixed-anhydride method and the active ester method. Polyclonal antibodies were produced through immunizing rabbits. 【Result】Two
7、haptens of toosendanin, toosendanin-succinil (TS) and toosendanin- glutaryl (TG), were synthesized successfully, and conjugated with BSA and OVA to form immunogens (TS-BSA and TG-BSA) and coating antigens (TS-OVA and TG-OVA). Two types of anti-toosendanin polyclonal antibodies (TS-Ab and TG-Ab) with
8、 high titers (6.4104 and 3.2105) were obtained. Optimized IC-ELISAs were established based on different antibody-antigen combinations. As measured with the combination of TS-Ab and TG-OVA, its limit of detection (LOD) for toosendanin was 0.03 gml-1, IC50 was 1.52 gml-1 and the linear range was from
9、0.01 gml-1 to 100 gml1. While assayed by (TG-Ab, TG-OVA)combination, its LOD was 0.11 gmL-1 in the linear range of 0.1-100 gml-1, and IC50 was 3.49 gml-1. The recovery of toosendanin was 82.4%-106.0% in tap water sample based on TS-Ab and TG-OVA combination, and the precision (CV%) was 1.1%-14.3%.【C
10、onclusion】Anti-toosendanin polyclonal antibodies with high titers were obtained due to the reasonable design of haptens，and based on these antibodies, rapid and effective IC-ELISAs format for detecting toosendanin were established. Key words: Toosendanin; Hapten; Polyclonal antibody; ELISA0 引言【研究意义】
11、川楝素（Toosendanin）是一种从楝属植物川楝（M. toosendan Sieb.et Zucc.）和苦楝（Melia azedarach L.）中分离得到的四环三萜类化合物，早先用于临床驱虫药物1，并具有抗肉毒毒素2，神经肌肉阻遏3，引发细胞分化和凋亡4等药理及生理作用。在农业上，川楝素对菜青虫等多种农田害虫有较好的拒食，毒杀及生长抑制作用5,6，作用机理独特7,8，目前已开发出一种新型植物源杀虫剂0.5%楝素杀虫乳油9。随着川楝素制品在农业生产上的广泛使用，建立高效、快速、灵敏的川楝素检测方法，对进一步开展川楝素的残留代谢，环境安全性，致毒机理等方面的研究有重要意义。【前人研究进展
12、】川楝素的常规检测方法为高效液相色谱（HPLC）法10，其免疫分析方法在国内外均未见报道。【本研究切入点】免疫分析方法较HPLC法，具有操作简便快速，省时省力等优点，近年来已成为农药小分子痕量检测领域的研究热点1113。【拟解决的关键问题】本研究通过对川楝素的半抗原改造及川楝素多克隆抗体制备方法的研究，以期获得高质量的抗川楝素多克隆抗体，建立快速有效的川楝素ELISA检测方法。1 材料与方法 1.1 试验材料川楝素（纯度98%，西北农林科技大学无公害农药研究服务中心），丁二酸酐（上海化学试剂公司），戊二酸酐（上海化学试剂公司），N羟基琥珀酰亚胺（NHS，Mercker公司），环二已基碳酰亚胺（
13、DCC，Mercker公司），二甲基甲酰胺（DMF，Sigma进口分装），三正丁胺（上海化学试剂公司），氯甲酸异丁酯（上海飞祥化工厂），四甲基联苯胺（TMB，Sigma公司），HRP-羊抗兔IgG（珠海百奥生物技术有限公司），卵清蛋白（OVA，Sigma进口分装，MW：45 000），牛血清蛋白（BSA，Sigma进口分装，MW：67 000），弗氏完全佐剂（FCA，Sigma公司），弗氏不完全佐剂（FICA，Sigma公司）。其它试剂均为分析纯。试验动物为新西兰大白兔（江苏省农业科学院实验动物中心）。1.2 主要试验仪器质谱仪（HP-5988，Agilent），核磁共振仪（Varian Me
14、rcury 300BB），红外光谱仪（Nicolet Avatar 360 FT-IR），紫外-可见分光光度计（Perkin ElmerLambda25），酶标板（96孔，COSTAR），酶标仪（Multiskan EX Version 1.0，LABSYSTEM），洗板机（Wellwash 4 MK 2，LABSYSTEM），移液器（Jencons Sealpette），超纯水净化仪（LABCONCO），低温高速离心机（IEC），分析天平（OHAUS），7821型磁力搅拌器（杭州仪表电机厂）等。1.3 试验方法1.3.1 半抗原TS和TG的合成 取287.0 mg川楝素，50.0 mg琥珀酸
15、酐，150.0 mg无水乙酸钠，20 ml无水丙酮置于反应瓶中回流反应10 h。反应过程中采用TLC监测反应进程，待川楝素大部分反应完后停止反应。滤去反应混合物中的固体，蒸除丙酮后加乙酸乙酯溶解，用3%的碳酸氢钠溶液提取3次，再分别用乙酸乙酯和乙醚洗涤提取液，水层用稀盐酸酸化后用乙醚提取，无水硫酸钠干燥，蒸除部分乙醚，冷却使结晶，滤集固体，通风橱内干燥后得105.0 mg，置于干燥器内备用。合成产物即为半抗原TS。采用上述方法，用戊二酸酐（57.0 mg）与川楝素反应，回流12 h，经无水硫酸钠干燥后浓缩，并用硅胶柱纯化，展开剂（二氯甲烷丙酮=41），收集馏分，浓缩得产物约81.0 mg，即为
16、半抗原TG14。合成路线见图1。 图1 川楝素半抗原合成路线Fig. 1 The synthetic routes to the haptens1.3.2 川楝素人工抗原的合成1.3.2.1 混合酸酐法合成免疫抗原 取28.7 mg TS和29.4 mg TG ，分别溶于1.5 ml DMF中，各加入75 l三正丁胺和20 l氯甲酸异丁酯，10搅拌30 min，得反应液A1和A2；称取80.0 mg BSA，溶于20 ml DMFH2O（v/v）=14的混合液中，分成两等份，得反应液B1和B2。将B1，B2置磁力搅拌器上，在4冰箱内将反应液A1和A2分别缓慢滴加到B1与B2中，30 min内加完。磁力搅拌下，反应过夜，最后将反
