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1、免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就 有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质 的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光 抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧 光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。一、基本原理及特点：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，
2、制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织 或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来 激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定 抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未 完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试
3、剂盒，有相当一部 分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定 中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。新发展了几种特殊的荧光免疫测 定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及 荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对 实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或
4、小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合 适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其 它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验 中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意 的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4C或-20C避光保存，以免因 标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像 WB 那样可以根据分子量的大小区分非特异性 识别，所以要得到一个完美
5、的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行 反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、 抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量， 才能最终达到你的实验目的。二. 荧光色素介绍：许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作 为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：（一）荧光色素1. 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate， FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或 酒精等溶剂。分子量为389.
6、4,最大吸收光波长为490495nm,最大发射光波长520530nm,呈现 明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体I型在效率、稳定性、与蛋白 质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是： 人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。2. 四乙基罗丹明（rhodamine， RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质 稳定，可长期保存。结构式如下：最大吸收光波长为570nm,最大发射光波长为595600nm, 呈橘红色荧光。3. 四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothioc
7、yanate, TRITC）结构式如下：最大吸引 光波长为550nm,最大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明， 可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。（二）其他荧光物质1 酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物 质。例如4-甲基伞酮-B-D半乳糖苷受B-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光， 激发光波长为360nm,发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过 氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。2.镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（
8、Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发 后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波 长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 所需要的仪器：荧光显微镜、显 微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器 激光共聚焦显微镜 荧光偏振免疫分析用偏振光激发标记物，利用结合竞争免疫原理，可以快速检测激素种瘤标志物、 维生素和多种治疗药物浓度。而且用于鉴定的材料也比较多样，可以是培养物、感染组织、分泌 排泄物，也可以是土壤、水、杂物等。应用于生物酶含量及活性测定、临床医学检验、食品分析 和环境监测、毒品检验。选择荧光素主要考虑以下几点
9、： 高消光系数（extinction coefficient）和光子产量（Quantum yield），这意味着光捕获能力强和效率高； 光稳定性较好； 与常见光源和滤光器匹配性较好； 不干扰抗体反映； 水溶性以及 pH 稳定性。此外，还需要考虑到是否有毒性以及荧光素的颜色是否与背景颜色 反差大对比鲜明等。三. 荧光技术平台介绍:1. 时间分辨荧光免疫测定以常用荧光素作为标记物的荧光免疫测定往往受血清成分、试管、仪器组件等的本底荧光干 扰，以及激发光源的杂射光的影响，使灵敏度受到很大限制。时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay, TR-FIA
10、）是针对这缺点加以改进的一种新型检测技术。其基本原理是以镧系元素铕（Eu）螯合物作荧光标记物，利用这类荧光物质有长荧光寿命的特点, 延长荧光测量时间,待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定,所得信号完全为长寿命镧系 螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。TR-FIA的测定原理见图17-4。以双 抗体夹心法为例的测定反应程序见图 17-5。其中增强液的作用是使荧光信号增强。因为免疫反应 完成后，生成的抗原抗体铕标记物复合物在弱碱性溶液中，经激发后所产生的荧光信号甚弱。 在增强液中可至pH23,铕离子很容易解离出来，并与增强液中的B-二酮体生成带有强烈荧光 的新的铕螯合物，大大有利
11、于荧光测量。所用检测仪器为时间分辨荧光计，与一般的荧光分光光 度计不同，采用脉冲光源（每秒闪烁1000 次的氙灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制 延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测定样品发出的长镧系荧光。检测灵敏度可达 0.2 1ng/ml。2. 解离增强镧系元素荧光免疫分析解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroimmunoassayDELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕Eu）连 接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的经过免疫反应之后生成免疫
12、复 合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解 离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光 的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此 称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。两对半定量测定乙肝病毒（HBV）标记物的检测方法常 用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由60年代末70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法 一酶联免疫吸附（ELISA）、同位素免疫标记（RIA）-化学发光免疫分析、生物发光、电化学发 光免疫标记和80年代中建立的稀土离子荧光标记（时间分辨荧光免疫分析
13、 ）等不同的检测方法。 随着科学的发展和检验技术的进步，其方法每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得 到不同的提高（其中 RIA为 10-12mol/L、ELISA为 10-9mol/L、CLIA为 10-15mol/L、ECL10为-17/L、TRF为10-18mol/L）。其中时间分辨荧光免疫分析（TRF）为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物，以单克隆抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入用铕（EU）标记的抗体，进 行反应检测，可大大降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点，提高了检测的灵敏度和准性， 该 TRF 法检测乙肝病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好，因干扰因素少可
14、大地优于以上 各种方法，可与HBV-DNA的检测相比（未经规范化要求开展的HBV-DNA检测，多年的临床实 验证明，假阳性、假阴性率较高，重复性差，且不能定量。）， TRF 为目前检测乙肝病毒标记物 最理想的方法。TRF定量检测乙肝病毒“两对半”为临床诊断乙肝提供了新手段，有助于临床客观 的分析 HBV 感染情况、疗效的观察和转归等情况的分析，至少可对下列情况更具有独特的诊断 价值：1治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。2治疗后定量 间接判断体内病毒数量，有助于疗效的观察。 3. 怀孕前进行定量测定，有助于选择有利的怀孕 时机。乙肝孕妇进行定量检查，有助于使部分病人得
15、到及时的正确的诊断 时间分辨荧光免疫定 量测定乙肝两对半的临床意义目前我科已正式开展了乙肝二对半的TRFIA定量分析，其每一项 的正常值范围均是由我国卫生部根据美国雅培的标准而制定，其灵敏度，准确度，及精确度都有 远远优于一般的 ELISA 法，乙肝两对半的定量制定将给临床提供一个关于乙肝诊断及疗效，预 后判断的更可靠的实验结果。1.极大地提高了检测的灵敏度 时间分辨荧光免疫定量技术（TRFIA）检测HbsAg灵敏度可达0.2ng/ml,而酶标（EIASA）检测的灵敏度是2ng/m 1,极大地 提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出HbsAg，确证HBV感染，缩短窗口期； 其次，可发
16、现低浓度HbsAg携带者；在部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对HBV包膜蛋白的 免疫应答，HbsAg表达较低，酶标检测 可出现HbsAg和HbsAb均阴性的情况，TRF技术则可 避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。 2.能动态观察疗效和监测病情 1） 定量分析 HBsAg和HBsAb的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。如HBsAg浓度降低，HBsAb 浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展；反之， HBsAg 浓度处于较高水平或上升趋势，而 HBsAb 一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。2）定量分析HBeAg和HBeAb 的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测HBeAg向HBeAb转换的时期， 即表现为HBeAg浓度下降和HbeAb升高的过程。高浓度的HBeAg还可间接提示病毒处于高复 制状态，具有较高的传染性。高浓度的HBeAb 方面提示病情好转，
