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1、分光光度计的使用一使用及维护1. 安装环境1.1 温度要求：装在不受阳光直接曝晒的房间； 最好装空调， 使室温维持 在（20土2C）；仪器附近不应有高温的暖气管或其它电热器具；仪器 后面板与墙之间应留一定空间。1.2 湿度要求：水蒸气在（1 3501 450）门口和（1 8001 950） nm两个 波长区域内有光吸收，会严重干扰测定。潮湿会导致分光器反射膜层 斑剥、脱落等。故相对湿度最好保持在（ 40 75）。高档紫外可 见近红外分光光度计要用高纯氮气冲洗。干燥筒内的变色硅胶应及 时更换。1.3 防震、防尘、防腐和防电磁干扰：2. 光源灯2.1 拿灯时不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照射后，
2、形成结痕难以 去掉 . 倘若不小心而碰触，应及时用无水乙醇抹擦干净。2.2 灯有寿命，要节约使用 . 但工作间歇时间短，不要关灯和停机 .2.3 在灯虽然能点亮， 但不稳定或强度大大减弱而影响测量时， 就应更换 新灯.2.4 应待灯冷却后，再重新启动 . 启动后预热 15-30min 才能读数 .2.5 不要用眼睛直视灯，因为紫外辐射会损伤人的眼睛。3. 单色器3.1 单色器是仪器的心脏部分 . 不要轻易装、拆，也不要去摸触镜面 .3.2 平时要保持内部干燥， 及时更换干燥剂， 以防止色散元件和反射镜受 潮而发霉，测定挥发样品必须使用密封吸收池， 以免样品蒸气进入单色器， 腐蚀反射镜、透镜及色
3、散元件的镜面 .3.3 如果选定波长和狭缝宽度是用旋钮， 则要按说明书规定的方向转动到 欲测的位置，切勿来回转动，以防回衡误差 .4. 样品室4.1 样品室是存放吸收池的地方， 防止样品的交叉污染， 决不可将样品留 在样品室中过夜 .4.2 吸收池的光学面一定要维护好，不能用刷子刷 . 否则光学面发毛会增 加散射而影响测定准确度 . 保护吸收池最重要的一条是使用后及时清洗， 否则留下液痕，日后再洗，事倍功半 . 用完的吸收池可放在中性肥皂水中（ 将十二烷基硫酸钠用蒸馏水配制成透明的稀溶液 ） ，或放在 8 mol l 盐 酸加 45乙醇的等量混合液中浸泡，然后用自来水冲洗，再用蒸馏水洗 净，放
4、在无灰尘的地方凉干备用 . 如果急于使用， 可在真空中抽干 . 但不要 用热吹风吹干。4.3 对于盛过蛋白质和核酸的样品池最好不要用市售的烷基磺化型的清 洗剂，因为它们有类似蛋白质的吸收光谱， 清洗不慎会引入误差， 所以此 时最好使用非离子型清洗剂 （ 如 triton） 浸泡. 如果吸收池实在太脏， 质量 好的吸收池可放在洗液中稍加处理， 但要随即取出冲洗， 不宜浸泡过长的时间。洗液必须冲洗干净，因为它也有类似蛋白质和核酸的吸收光谱。4.4 为了精确的定量测定，吸收池应事先进行校正 . 校正的办法是在池中 加入欲测浓度的溶液，读出各吸收池的吸光度 . 以一个池为标准读出其他 各池的吸光度 .
5、 然后在读取样品吸光度后， 再予校正 . 市售常规光径 （10mm） 的吸收池一般匹配到O.OImm.为了某种工作的需要（如差示光谱测定）必须寻找匹配池时， 可在池中装入高吸收的样品， 读数后加以挑选。 一台仪 器上的比色皿不得与其它仪器上的比色皿单个调换。 比色皿每次用完后应 立即用蒸馏水洗净，用软布或擦镜纸擦干，放于比色皿盒内。5. 倾注溶液时要小心， 不要弄湿外壁 . 如不慎弄湿，可用滤纸轻轻吸干后， 再用绸布或擦镜纸擦净 （最好用白绸，擦镜纸常有纸毛 ） 。6. 检测器：检测器室要保持干燥， 以保证绝缘良好 . 在使用光电倍增管时，最重要的一点是通电后避免不必要的曝光。在仪器的光电倍增
6、管的前面 （通常在样品室的上方 ）常有暗闸（微动开关 ） ，这是光电倍增管的保护装 置，用来保护其在开启样品室盖时，不受日光照射 . 否则通电后的光电倍 增管，受强光照射，会造成永久性的损坏，或至少因“疲劳 而降低灵敏度。7. 硫化铅光电池忌受紫外线照射，否则会降低其灵敏度。8. 仪器用完后应用罩布盖好，以防落入灰尘。9. 仪器应每半年左右或搬动后应检查波长精度等，以确保仪器性能正常。 二分光光度计的性能检查1 波长范围 指分光光度计上限波长和下限波长之间的工作范围，在这个范围内的 所有波长应具有足够的能量进行工作 . 这种检测波长极限是与光源、单色 器及检测器的光谱响应特性有关的 . 如波长
7、范围为 19O-9OOnm 的紫外 -可 见分光光度计必须具备氘灯和碘钨灯两个光源， 而只有碘钨灯的分光光度 计的工作范围，在短波侧不能低于 340nm.有时在说明书规定的工作波长 范围的两端由于缺乏足够的能量， 不能正常工作 . 如在两端表现为 1OOT 或A设定困难，或基线在两端不平直等，就需要检查可能发生的原因，如 光源位置需要调整、 光源需要更换、 样品室窗口有溶液污染、 光路需要调 试、检测器疲劳等等。2 波长准确度波长准确度 （有时被误称为波长精度 ）是指仪器波长指示器上所指示 的波长值与仪器给出的实际波长值之间的符合程度，可用二者之差 （即波 长误差）来衡量其准确性.如某分光光度
8、计的波长准确度为土 1.Onm,那么 测定253.65nm汞灯辉线的最大能量应落在 252.65nm和254.65nm之间.波长准确度对分光光度测定是有很大影响的， 因为任何分光光度定量 分析工作都是依靠在一定波长下测量吸光度值 （ 此波长大都选在样品的 吸收峰位 ）来完成的 . 如波长有误差， 则由于峰两旁陡坡处吸光度值随波长 的变化极为迅速，会造成明显的吸光度误差 . 如在定性分析时单纯依靠样 品的吸收峰来确定波长，可能会造成错误的判断 . 在有机物质的结构分析 中，需要研究吸收峰波长位置与物质结构的关系 . 如仪器的波长误差较大， 显然会影响结构分析的正确性 . 波长准确度对于窄带分析是
9、非常重要的， 但对于宽吸收带则影响不大 . 常用的检查方法如下：21. 用氘灯 （或氢灯 ） 的辉线检查氘灯（ 或氢灯） 为紫外 -可见分光光度计必备的光源，因此用它来标定波长 最为方便 . 氘灯虽然在紫外区发射连续光谐，但在可见区有一条辉线，656.1 nm（氢灯有两条：656.3nm和 486.1 nm）.待仪器和氘灯稳定后， 选择合适的测定条件： 单光束、 纵坐标用能量 表示、狭缝尽可能小、响应尽可能快、扫描速度慢、图纸速度快 . 在上述 波长附近扫描， 或按说明书规定的波长旋转方向慢慢旋转波长钮， 读出结 果显示最大能量的波长 . 如果超出允许波长误差，就需进行校正 .2.2 用汞灯的
10、辉线检查 上述用氘灯检查波长只能在少数波长点进行， 但对仪器作精密的波长校正， 应在整个波长范围的不同区域进行 . 在紫外 -可见区，理想的波长校正基准 工具是低压汞灯 .低压汞灯发射不连续光谐 （线光谐 ）. 在紫外 -可见区有很多辉线可供 仪器波长校正 . 方法与用氘灯检查相同 .作为紫外 -可见分光光度计任选附件的汞笔灯是进行波长准确度检查 的最合适的工具 . 汞笔灯体积小，携带方便，便于在分光光度计中安放 . 2 3 用标准玻璃滤光片检查对于低档分光光度计（谱带半宽度在10nm左右）只需用标准玻璃滤光 片来检查.如钕滤光片，它的最大吸收峰在585nm.只要把滤光片放在样品 室中，按操作
11、程序扫描吸收光谱即可 .如果用氧化钬滤光片来检查，则效果会更好 . 氧化钬滤光片最大吸收 波长 241.5nm、360.8nm、536.4nm.2.4 用样品溶液的吸收光谱检查- 些样品的吸收光谐，如氯化钬溶液 （最大吸收波长为 241.1nm、 333.4nm、361.5nm）、硫酸钻、硫酸铜、铬酸钾、重铬酸钾溶液都可用作 波长校正的参比 . 但用样品溶液校正不及用光源的谱线校正精确 .仪器引起波长误差的原因大致如下： 工作环境温度变化太大、 单色器 受震后引起色散元件移位、 波长扫描系统机械零件磨损、 仪器积尘太多使 转动受阻、光谱记录纸受潮伸缩变形等 .3. 波长重复性波长重复性是定性分
12、析的重要因素， 由于波长位置不能准确重复， 就 不能准确判定吸收峰的位置，甚至引起判断错误 .用一个已知样品吸收峰或灯的辉线作标准， 在相同条件下多次重复读 取峰位 . 计算每次观察的波长对平均值的偏差，这些偏差的平均值就是此 分光光度计的波长重复性 .引起波长重复性下降的原因与引起波长误差的原因相似， 当然电子系 统工作不稳定也是原因之 - 。4. 谱带半宽度谱带半宽度又称有效带宽， 这里是指离开单色器的出射狭缝的辐射光 谱的峰高的一半处的谱带宽度 . 光源辉线或锐的吸收光谱都可用于分光光 度计谱带半宽度的检查 .谱带半宽度这个性能指标直接影响样品测量的准确度.使用2nm谱带 半宽度的检测效
13、果显然要比20nm好得多.如使用微量池，必须使用谱带半宽 度小的分光光度计，否则从出射狭缝来的光斑会超过样品池的宽度，而给测 定带来误差 .分光光度计谱带半宽度不符合性能指标常常是由于单色器中狭缝系统 或狭缝伺服系统的故障，应请专业人员协助修理。5. 杂散光 杂散光是指由检测器接收到的任何由仪器单色器分离的光谱范围以外 的辐射.杂散光可以分成两种形式， 一种是杂散光波长与测定波长相同 . 它是由于 测定波长因种种原因偏离正常光路， 在不通过样品的情况下， 直接射到检测 器上.引起这种杂散光的原因是由于光学、 机械零件 （包括吸收池或样品本身 ） 的反射和散射所引起的 . 这种杂散光可以通过一个
14、不透明的样品来检查 . 当 发现放在样品池中的不透明样品的透光度不为零时， 说明仪器中有上述杂散 光存在. 但必须注意不要与光度刻尺的零位误差混淆 .第二种杂散光是指测定波长以外的偏离正常光路到达检测器的光线， 通 常由光学系统中的缺陷所引起， 如不必要的反射面、 光束孔径不匹配、 灰尘 的散射、光学元件表面被擦伤、 不均匀色散等都会降低光线的单色性， 使杂 散光增加. 仪器光学系统设计不良、零件加工不良、位置错移等也是造成杂 散光的原因 . 通常指的是第二种杂散光 .杂散光的影响使测量结果偏离比尔定律 . 当杂散光被样品吸收时，偏离 是正的，即观察值大于真实值 . 当杂散光不被吸收时，偏离是
15、负的、观察值 小于真实值 . 杂散光对吸光度的影响是在吸光度愈大时愈明显 . 如 1的杂 散光强度可以使吸光度从1.000降到0.9629,但可使吸光度从3降到1.963.由于杂散光强度在边缘波段比较大，因此在波长小于220nm进行光谱扫描时,必须小心有无“假吸收峰 出现 . 原来样品随波长变短而吸收增大, 可是由于杂散光在短波时急剧增大，因而使原来逐渐增大的吸光度反而变 小，就会出现不应有的“假吸收峰 .当被测定的波长的能量降低时， 杂散光比例就相应增加 . 对仪器输出的 边缘波长来说，单色器的透光度、光源强度和检测器的灵敏度都是比较低的， 这时杂散光影响就更为明显 . 所以在紫外 - 可见
16、分光光度计中应该先检查 200-220nm 340nm处的杂散光.简便的杂散光测试方法是测定在规定波长下几乎完全不透明的溶液或 滤光片的透光度 . 选择一种材料，它对于边缘波长的光能是完全吸收的，而 对中间波长的透光度却相当高 . 测定这种材料在边缘波长的透光度，直接就 反映了杂散光的强度 . 这种材料称为长、短波截止材料 . 截止材料的截止性能 应尽可能尖锐，溶液截止的尖锐程度比固体好 .在测定杂散光时，注意不要把试样室的漏光与仪器的杂散光相混淆 .由 于漏光而引起的杂光将会随着狭缝宽度的增加而迅速下降 . 而仪器本身的杂 散光并不会因为狭缝的开闭而产生明显的变化 .6. 分辨率分辨率是指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔， 是衡量分光 光度计性能的重要指标之一 . 单色器输
