《诊断试剂盒》由会员分享，可在线阅读，更多相关《诊断试剂盒（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、结核性胸腔积液特异性诊断试剂盒的研制一、项目可行性报告(一) 立项的背景和意义。结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(m ycobacterium tuberculosis, MTB)引起的以 呼吸道传播为主的慢性传染病，是当今世界由单一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病， 严重威胁着人类的健康。特别是近10年来由于人口剧增、耐药性的产生、人类免疫缺陷病 毒感染流行、免疫抑制剂的使用等原因，结核病日益严重，全球结核病疫情骤然回升。据 资料报道，当前全球1/3的人感染了结核杆菌，每年有800 万至 1000万新发结核病患者， 有 300 万人死于结核病1-4。我国的结核病流行
2、情况十分严峻，结核病人数位居世界第二位， 约占全球结核病人的四分之一，是全球22个结核病高负担国家之一，每年由结核病带来的 直接经济损失超过40 亿。2000 年在我国 31 个省、直辖市、自治区组织进行第四次全国结 核病流行病学抽样调查，结果显示全国人口结核感染率为45%，高于WHO估计的1/3水 平，估计全国结核菌感染者5.5 亿。农村结核患病率高于城市，西部地区患病率高于东部 地区。全国现有活动性肺结核病人 451 万，菌阳肺结核病人 196 万，每年死亡人数约 13 万，在传染病中居第一位，是其它各种传染病和寄生虫病死亡人数总和的 2 倍，结核病的 发病数和死亡数自2005年初以来居2
3、7种甲乙类传染病首位，结核病已经超过肝炎一跃成 为我国危害最严重的传染病。因此在全国范围内采取有效遏制结核病的策略刻不容缓5-8。(二) 国内外研究现状和发展趋势。由于结核主要通过飞沫传播，因此结核病的早期诊断非常重要，利用简单、快速、准 确的实验室检查尽早对结核病做出诊断对控制结核病疫情至关重要。然而目前，结核病的 诊断现状不尽人意，体外分枝杆菌分离培养是诊断结核病的金标准，其缺点是：培养周期 长(约 6 周)，假阳性率高9。近年来应用于临床的 Bactec 分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统可 将阳性标本检出时间缩短至平均9天，鉴定、药敏试验时间平均为4天，然而Bactec仪器 价格昂贵，需进口
4、厂家的专利液体培养基，费用较高，且方法仍然建立在以细菌培养的基 础之上，不管是检测菌体还是检测代谢产物，都要通过分枝杆菌的自然生长以积累菌量方 能检出，而分枝杆菌的生长相对缓慢，因而它们都难以突破“慢”的限制10。结核病诊断的 免疫学检测，目前仍普遍基于感染免疫学的概念检测结核菌抗原及其特异性抗体，国内外 研究者采用脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、脂多糖(LPS)、结核菌重组蛋白相对分子量38 000 等或其他纯化蛋白作为抗原，以胶体金标记，建立简便、快速免疫学诊断方法，如分子量 38 000 的金标渗滤试剂以及结核特异性抗原免疫印迹检测技术。但是，由于结核菌在属间 和种间存有共同的抗原决定簇，加
5、之其与体液免疫的相关性目前尚未得到充分的阐明，因 而在综合提高实验的敏感性和特异性方面未能取得实质性的进展11-13。结核病免疫学检测， 目前最常用的是PPD试验，以机体对注射的PPD是否产生变态反应来判断机体曾否感染 过结核菌而作为一项辅助诊断指标。但是，由于PPD中含有许多分支杆菌共同的抗原，如 卡介苗接种者 PPD 试验可呈现阳性结果， PPD 皮试阳性并不能鉴别是因为结核分枝杆菌 复合群感染还是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏。PPD皮试诊断的 特异性差，用该方法进行结核病流行病学调查获得的结核分支杆菌感染率并不能真正反映 人群中结核分支杆菌感染的实际状况。重症肺结核病
6、人则往往因为机体免疫力低下而呈现 阴性结果等情形，都大大降低了其临床价值14。另外，近年来发展起来的分子诊断技术如 PCR、PCR-RFLP、real-time PCR以及基因芯片技术，大多数需要数小时才可以得到结果， 且这些技术需要昂贵的仪器，存在假阳性和假阴性的问题，对实验室硬件和检测人员素质 要求较高，故非常不适用于现场的快速检验、早期排查和诊断4, 15, 16。时间分辨荧光分析法（time resolved fluoroimmunoassay, TRFIA）是近十年发展起来的 一种微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术，灵敏度完全可与放射免疫分析技术相 媲美，甚至超过放射免疫分析的
7、水平。时间分辨荧光分析法实际上是在荧光免疫分析（fluorescent immunoassay, FIA）的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。在通常的荧光 分析中，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景荧光（来自胶体颗粒和溶剂分子引起的 散射光、血清蛋白质和其他化合物发出的非特异性荧光）强度大，干扰强，成为荧光分析 法大范围推广使用的瓶颈。时间分辨荧光免疫分析法可以有效的解决这一难题。它的基本 原理用镧系金属离子（如Eu3+、Sm3+、Tb3+、Dy3+ ）作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、 抗体、核酸探针或生物活性细胞，镧系元素作为示踪剂有以下特点：荧光物质激发光谱 曲线的最大吸收波长和发射
8、光谱的最大发射波长之间的差，称为Stokes位移。普通荧光物 质荧光光谱的Stokes位移只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰 严重。镧系元素Stokes位移达200nm,很容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰； 镧系元素与普通的荧光团比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间长，为传统荧光的 103106倍，镧系元素的荧光半衰期介于101 OOOys之间。这样，用时间分辨荧光仪测 量镧系元素的荧光时，在脉冲光源激发之后，可以适当的延迟一段时间，待血清、容器、 样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量，这时就只存镧系元素标记物的特异性荧 光。通过时间延迟和波长分辨，极大
9、地降低了本底荧光。待反应 （如抗原抗体免疫反应、 生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后，用 时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，即可推测反应体系中分析物的浓度，达到定 量分析的目的。TRFIA具有以下优点：灵敏度高，检测下限为lpmol,达到或超过放射 免疫分析水平；线性范围宽，可达6个数量级，远远宽于ELISA的线性范围，也超过化 学的线性范围；不受样品中自然荧光干扰，背景低；可多重标记(如两种不同的抗原 可分别用Eu3+、Sm3+标记)，一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目；操作 简便、易自动化，标记物制备简便且稳定，无放射性污染。由于T
10、RFIA技术集酶标记、同 位素标记技术的优点于一身，同时又克服了它们的局限。因此， TRFIA 是一种公认的继 RIA、 EIA 之后最有发展前途、值得推广的非放射免疫标记技术，目前已经成为基础医学 研究和临床治疗监测等方面的重要手段17-19。近年来，人们对结核分枝杆菌培养的滤液进行了深入的研究，分离出了多种分泌蛋白， 如 MPT64、PT70、MPT63、MPT53、Ag85、CPF10 和 ESAT620。其中，结核杆菌培养滤 液蛋白 10(culture filtrate protein 10, CFP10)和早期分泌性抗原靶 6(early secretory antigenic t
11、arget-6, ESAT6)为结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌所特有，卡介苗(BCG)及非致病分枝 杆菌缺乏。CFP10与ESAT6同属于ESAT6家族，且由同一操纵子调控，产生的蛋白能诱 导机体产生强烈的免疫应答21-24。ESAT6分子量很小，仅6KD，难于用双抗夹心法进行检 测。本研究采用时间分辨荧光免疫分析双抗夹心技术，建立了定量检测CFP10的方法，初 步临床试验结果表明，CFP10用于结核患者血清检测敏感性较低，但用于结核性胸腔积液 的诊断敏感性在 80%以上，特异性达 100%，是一个非常有开发潜力的结核病新型诊断试 剂盒，可以有效地鉴别诊断结核性、癌性和其他感染性胸腔积液。参考文
12、献：1 Miller TL, McNabb SJ, Hilsenrath P, et al. Personal and societal health quality lost to tuberculosis. PLoS ONE. 2009. 4(4): e5080.2 Otero L, Krapp F, Tomatis C, et al. High prevalence of primary multidrug resistant tuberculosis in persons with no known risk factors. PLoS One. 2011. 6(10): e26276
13、.3 Lunc C, Enache E, Olaru SePt,al. Monitoring of Mycobacterium tuberculosis infections in Iasi County in 2009. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2011 Jul-Sep;115(3):718-22.4 Asiimwe BB, Joloba ML, Ghebremichael S,et al. DNA restriction fragment length polymorphism analysis of Mycobacterium tuberculosi
14、s isolates from HIV-seropositive and HIV-seronegative patients in Kampala, Uganda. BMC Infect Dis. 2009. 9: 12.5 黄禹吉. 结核病现状及控制策略. 应用预防医学. 2008. 14(2): 1-4.6 郭凌, 范立东 . 结核病发病率回升因素调查分析 . 中国卫生检验杂志 . 2008. 18(7): 1414-33.7 甄新安, 苏振修, 刘占峰, 等. 结核并艾滋病病毒感染患者的治疗管理效果分析 . 临床 荟萃. 2011. 26(17): 1514-15.8 董海燕, 张建中,
15、 万康林, 等. 结核分枝杆菌毒力相关因子研究进展 . 医学研究杂志 . 2011. 40(6): 157-60.9 侯史文, 方宏安, 宋秀兰,等. 结核分枝杆菌培养及初始耐药监测. 浙江临床医学. 2008. 10(4): 552.10 Sun JR, Lee SY , Perng CL, et al. Detecting Mycobacterium tuberculosis in Bactec MGIT960 Cultures by Inhouse IS6110-based PCR Assay in Routine Clinical Practice. J Formos Med Asso
16、c. 2009. 108(2):119-25.11 Lagrange PH, Simonney N, Herrmann JL. New immunological tests in the diagnosis of tuberculosis. Rev Mal Respir. 2007. 24(4): 453-72.12 Nicol MP, Pienaar D, Wood K, et al. Enzyme-linked immunospot assay responses to early secretory antigenic target 6, culture filtrate protein 10, and purified protein derivative among children with tuberculosis: implications for diagnosis and
