《实验植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测（2010 级生态班实验方案）一、实验目的1. 明白得用CTAB法提取植物组织DNA的原理。2. 把握CTAB法提取植物组织DNA的方式。3. 了解真核基因组DNA的有关特性。二、实验原理由于植物细胞含有细胞壁及其细胞内高含量的多糖物质，因此一样的提取 真核细胞基因组DNA的方式用在植物细胞上并非十分有效。十六烷基三乙基溴 化铵（ce tyl trie thy lammonium bromide, CTAB ）法是经常使用的提取植物细 胞基因组DNA的方式。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复 合物，在高盐溶液中（L NaCl）时，CTAB
2、-核酸复合物是可溶的，当降低溶液 盐浓度到必然程度（L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸 复合物与蛋白质、多糖类物质分开。CTAB-核酸复合物再用70 75%酒精浸泡可 洗脱掉CTAB。再通过氯仿/异戊醇（24:1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯 化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。植物DNA的提取程序应包括以下几项：必需破碎或消化细胞壁释放出细 胞内容物；必需破坏细胞膜及核膜，使DNA释放到提取缓冲液中，经常使用 CTAB 一类的去污剂使细胞膜崩解；DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、 多糖等杂质，可利用氯仿、RNase等除去。一旦
3、DNA释放出来，其剪切破坏的 程度必需要降到最低。CTAB法提取植物DNA，方式比较简单，适用于大多数植 物。尽管取得的DNA纯度不是很高，但仍能知足限制性内切核酸酶分析或PCR 扩增的要求。三、实验材料、试剂和仪器1. 材料2. 新鲜的植物组织（如幼叶、花器、幼根）或-80C冻存的材料。3. 仪器、用具:离心机、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、pH计、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪、电泳槽等。4. 试剂(1) 2 x CTAB 缓冲液：CTAB(W/V)Tris-HCI pHEDTA pHNaCl2%100 mmol/L20 mmol/L mol/LPV
4、P(聚乙烯吡咯烷酮)1%(2) TE 缓冲液(pH :称取 1.211 g Tri, 0.372 g EDTA-Na,先用 800 mL2蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH，再用蒸馏水定容至1000 mL。 高压灭菌20 min。(3) 氯仿/异戊醇(24:1,v/v):将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀， 置棕色瓶中，4C保留。(4) B-巯基乙醇5) 70%乙醇6) 乙醇或异丙醇(7) 5XTBE电泳缓冲液(1L)：54gNa EDTA 2H O223.72gTris硼酸临用前稀释至XTBE电泳缓冲液(8) 6X上样缓冲液：溴酚兰、40%蔗糖9)四、实验步骤(一)植物DNA提取1. 在5
5、mL离心管中，加入1000 口 l的2XCTAB, 65C预热。用前加入20 口 l B- 巯基乙醇。2. 取嫩的组织材料g,放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用 干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，充分混匀后置65C水浴中保 温45-60min，并非时轻轻转动试管。3. 加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地倒置混匀，室温下10 OOOrpm离心10 min， 移上清至另一 5 ml新管中。4吸上清到新管中（5mL离心管），用氯仿/异戊醇重复抽提一次。5.加入2倍体积的100%乙醇或倍体积异丙醇，会显现絮状沉淀，-20C放置30 min 或-80C放置 10min，12 000r
6、pm 离心 10T5min 回收 DNA 沉淀。6弃上清，用70%乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于适量的灭菌ddH O或TE缓冲2液中。7.用紫外分光光度计在260 nm、280 nm波长别离读数。其中260 nm读数用来 估量样品中DNA的浓度，OD /OD的值用于估量DNA的纯度。1个OD值相当于260 280 26050ug/ml 双链 DNA。样品浓度（口 g/ml）=OD x稀释倍数x 50260关于DNA纯制品，其OD /OD 。OD /OD 说明有RNA污染；OD /OD 260 280 260 280 260 280 说明有蛋白质污染。注意，提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。
7、轻轻操作DNA溶液和快速 冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割超级重要，不能振荡，不能利用太 细口的吸头，也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物 DNA抽提中的要紧污染物，提取材料要尽可能利用幼嫩叶片。若是试材较老、多 糖含量咼，在提取缓冲液中应提咼B-巯基乙醇的用量，且在用氯仿/异戊醇抽提 之前先用酚：氯仿:异戊醇抽提一遍，如此去除蛋白较为完全。所得DNA应为无色或灰白色，假设呈褐色那么有多酚类物质污染；对多糖含量高的材料，提取液 中CTAB的浓度可增至3%或更高。(二)琼脂糖电泳检测DNA制作的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液10 口 L+ 4 口 L上样缓冲液，电
8、泳检测。用入DNA做分子量大小的Marker，若是带型不弥散，在与Marker 20 kb的带的相应位置显现整齐敞亮的条带，说明DNA完整，没有降解。(1) 制胶槽水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与制胶槽之间留1mm空 间。(2) 称取DNA电泳用琼脂糖0.4g放入250ml的三角烧杯中，加入50ml XTBE 缓冲液，混匀后，将烧瓶放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解(每 块胶用20 ml左右融化的的琼脂糖凝胶，每两组配50ml %的琼脂糖凝 胶)。(3) 掏出三角烧瓶，将其置室温下冷却至60C左右(手握烧瓶能够耐受)， 即将凝胶溶液倒入制胶槽中。(4) 室温下待凝胶完全凝固，需时约30
9、分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳 槽中。(5) 在电泳槽中加入XTBE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。(6) 取一 PE手套(用PE手套混合样品和上样混合液，样品整体积不宜超过 15口L)，如下表所示预备电泳样品，用移液器混匀序号1234样品入 DNA/HindIIIDNA溶液DNA溶液DNA溶液体积5口L58106X上样缓冲液2口L2口L3口L4口L7) 用加样器吸取样品。依次别离加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置 于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要避免将样品溢出孔外。8) 接通电源，调剂电压至 80伏，电泳直至溴酚蓝指示剂距胶底 1cm 处将凝胶板掏出，用凝胶成像系统成像或在紫外灯下观看结果，拍照。
