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1、豆豉中黄曲霉毒素B1测定方法研究刘宏程1*作者简介：刘宏程（1975），男，硕士，主要从事食品安全研究。通信地址：昆明学府路农业部农产品质检中心，云南省农科院。Email:.云南省农科院院立课题资助,邹艳红1,张玉荣2，黎其万1, 黄思司1，杨东顺1（1农业部农产品质量监督检验测试中心（昆明），云南省农业科学院，昆明, 650223; 2玉溪市农业科学院，玉溪，653100）摘要 用间接竞争性ELISA法测定豆豉中黄曲霉毒素B1(AFB1)，结果为阳性，用荧光检测器测定的HPLC方法验证，结果为假阳性。ELISA法测定AFB1步骤简便、快速、操作安全，但对豆豉样品容易产生假阳性，需要通过HPL
2、C方法确认。建议豆豉样品不宜采用ELISA测定黄曲霉毒素B1。关键词 黄曲霉毒素B1 酶联免疫吸附法 高效液相色谱 豆豉Determination Of Aflatoxin B1 In Lobster Sauce Was ResearchedLiu Hongcheng1*, Zhou Yanhong1, Zhang Yurong2, Li Qiwan1, Huang Sisi1, Yang Dongshun1(1Supervision & Testing Center for Farm Product Quality, ministry of agriculture, (Kunming), Y
3、unnan academy of agriculture science, Kunming 650223; 2Yuxi academy of agriculture science, Yuxi, 653100, China)Abstract: Aflatoxin B1 in Lobster Sauce is determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), the result is true; It that is validated by HPLC with Fluorescent is false. Determinatio
4、n of AFB1 is simple, rapid, safe by ELISA, but its result is false in lobster sauce, which is validated by HPLC. It is not recommended that the method of determination AFB1 in lobster sauce by ELISA.Key word: AFB1, ELISA, HPLC, Lobster Sauce黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是真菌毒素中毒性最大的一种，是世界上公认的最强化学致癌物质，危害性在于对人及动物
5、肝脏组织有破坏作用,严重时,可导致肝癌甚至死亡.，1993年被WHO癌症研究机构划定为类致癌物。在天然污染的食品中存在的黄曲霉毒素以B1(AFB1，结构如图1)污染最多见，其毒性和致癌性也最强。要严格控制食品中黄曲霉毒素的含量，必须要有快速、灵敏、准确、有效的分析测定方法作保证。图1 黄曲霉毒素B1分子结构式 （Fig1. structure of aflatoxin B1 AFB1）目前检测AFB1的方法主要有酶联免疫吸附法,薄层色谱和高效液相色谱法。酶联免疫吸附法1-3是目前测定黄曲霉毒素B1的快速方法，灵敏度高、检验速度快、操作安全，成本低，由于该方法是生物化学法，具有对酸对盐敏感的特点
6、，易出现假阳性结果, 需要结合其他分析方法进行确认如同位素稀释质谱4、薄层色谱5、HPLC/MS6和免疫亲和净化法7等。高效液相色谱法8，9测定黄曲霉毒素具有准确度高、精密度好的特点，主要用于测定粮谷10-12，玉米13、花生14、中药15中黄曲霉毒素B1。在进行无公害食品-豆豉的认证过程中，按国家标准16利用酶联免疫方法对豆豉样品中AFB1残留的测定，结果为阳性，通过选择最佳色谱条件，在HPLC上把干扰物质和AFB1完全分离，可以确认豆豉中AFB1为假阳性，对于其他豆豉样品也有类似情况存在，建议豆制品不宜采用ELISA方法进行测定，有条件实验室宜采用HPLC方法直接进行测定。1.实验部分1.
7、1 仪器及试剂 Model 680 酶标仪（Bio-Rad 公司），酶标微孔板（96 孔），恒温水浴锅，恒温培养箱，微量加样器及配套吸头， Alliance 2695 高效液相色谱仪(Waters公司)，配置四元泵溶剂淋洗系统，自动进样系统，2475荧光检测器， Sartorius纯水器(Germany公司)。试剂：三氯甲烷（分析纯），甲醇（分析纯），乙酸（优级纯），甲醇和乙腈（Fisher, HPLC级）。黄曲霉毒素B1试剂盒（北京百林康源生物有限公司）包含：PBS-T洗液，抗体，酶标二抗，阴性对照液，底物，底物液A，底物液B，终止液。1.2 样品溶液制备及测定 准确称取20g粉碎样品于25
8、0mL具塞锥形瓶中，准确加入60 m L三氯甲烷，盖塞后滴水封严。150r/min振荡30min.。静置后，用快速定性滤纸过滤于50m L烧杯中。立即取12m L滤液（相当4.0g试样）于75m L蒸发皿中，60水浴通风挥干。用2.0mL20%甲醇PBS分三次（0.8m L、0.7m L、0. 5 m L）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置分别用ELISA和HPLC进行测定。1.3 ELISA 测定方法抗体抗原反应:将稀释过的抗体与等量样品提起液在玻璃管内混合震荡后室温静止15min。此液用于测定试样中黄曲霉毒素B1含量。封闭:已包被的酶标板用洗液洗3次X2 min洗板后
9、在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入样品的抗体抗原反应液及空白对照液和阴性对照液，130L /孔，置37湿盒中孵育2h后，倒掉反应液，用PBS-T洗液3次X3min洗板后拍干。酶标记反应：加入经稀释后的酶标二抗，100L/孔，置37湿盒中孵育1h后，倒掉反应液，用PBS-T洗液5次X3 min洗板后拍干。显色反应：待底物充分溶解后加入酶标板，100L/孔，置37反应15min后，加入终止液，40L /孔。测定：酶标仪设置490 nm测出OD值。根据标准竞争抑制曲线图（ELISA 试剂盒中带有）求出待测样品AFB1含量。最低检测限为：0.01 g/kg。通过该法测定豆豉中黄曲霉毒素B1 结果为57
10、g/kg。1.4 HPLC 确认待测液经0.45m滤膜过滤，取10uL进样，测定峰面积，按外标法定量。色谱条件：色谱柱Symmetry Shield (4.6250 mm，5m)，流动相：甲醇+0.1%醋酸+乙腈（20:65:15,V:V）为流动相，柱温30，流速1.2mL/min，2475荧光检测器，激发波长和发射波长分别为336 nm, 445 nm，进样10L。2.结果与讨论2.1 ELISA试剂盒优点 检测灵敏，最低检测限为0.01 g/kg，是HPLC方法的100倍，而且该方法不需要使用黄曲霉毒素B1标准品，从而保证操作者的人身安全，安全性能高，检测样品数量大，一次能测定92个样品。
11、2.2 HPLC分离条件选择 通过对比symmetry shield (4.6250 mm，5m)和Novapak (3.9150 mm，5m)在不同流动相比率和不同流速条件下AFB1和豆豉样品的分离条件，寻找豆豉样品和AFB1的最佳分离条件。由于AFB1含有二羰基化合物，有活泼氢，拖尾严重，为改善峰形，需在流动相中加入少量酸。在短柱Novapak (3.9150 mm，5m)，流动性为甲醇+0.1% 醋酸（65%:35%，V/V）中，AFB1和杂质出峰时间相邻很近；在symmetry shield (4.6250 mm，5m)，流动相为甲醇+0.1% 醋酸+乙腈（20%:65%:15%，V/
12、V），AFB1和干扰物质能完全分离，如图2，AFB1在14.926min出峰，杂质在10.657min出峰，证明该物质为豆豉中本底干扰物质。 图2，AFB1标样和豆豉样品色谱图（Fig 1 the chromatography of standard solution of AFB1 and lobster sauce）2.3 定量标准曲线、检出限及日内稳定性实验, 配置浓度为3, 30, 60, 300, 600g/L的AFB1标准溶液，取10L进样，测定峰面积，以峰面积对浓度作曲线。计算出回归方程，AFB1在0600 g/L线性关系良好。在所选条件下，回归方程分别为Y=5.59e+004X
13、 (相关系数r=0.9941) 。根据信燥比S/N=3，测得AFB1的仪器最低检出限LOD为1.0 g/L。分别测定AFB1的精密度和日内稳定性，7次测定峰面积的相对偏差小于1.5%，每1小时进1次，8小时内峰面积的相对偏差小于1.97%。说明AFB1在常温下较稳定，不容易分解（注避光条件下）。2.4 样品的测定 在其他三个无公害认证产品豆豉样品中通过ELISA方法测定结果都出现假阳性，结果从0.3-80 g/kg含量高低不一。通过市场买到的豆豉样品中，也有同样问题存在，都需要通过HPLC进行确认。3 小结由于荧光检测器只对带荧光基团的物质有响应，在HPLC上干扰很小（有一个干扰物质），很容易
14、分离，结果准确、可靠。在豆豉中有某种物质在ELISA中会发生显色反应，出现假阳性结果。所以豆豉不适宜使用ELISA方法进行测定，建议直接使用HPLC进行测定。参考文献1 柳洁 何碧英。现代预防医学，2005，32（5），467-469。2 刘冬儿。 食品工业科技，2002，23（10），78-80。3 杜平华 杨晓峰。 药物分析杂志，1995，15（2），34-36。4 Scholl PF, Turner PC, Sutcliffe AE, et. al.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006, 15(4):823-6.5 柳其芳。中国热带医学，2006，
15、6（2），246-248。6 Alvarez MT, Carvajal M, Rojo F, et. al. Nat. Toxins. 1999; 7(4):139-45.7 Chan D, MacDonald S.J., Boughtflower V, et. al. J. Chromatography A, 2004, 1059, 13168 Anne M., Virginie F. A, Marcel C. A et. al. Food Chem. 2005, 92, 3914009 Tar A, Rosell M.G., Guardino. X. J. Chromatography A, 2004, 1047, 23524010 姜兆兴，曹旭，李智瑾。粮食与食品工业 2005，12（6），61-63。11 柳洁，何碧英。现代预防医学 2002，29（2），137-140。12 孙秀兰， 赵晓联，汤坚。食品科学，2004，25（7），128-131。13 文镜。食品科学，1996，17（1），68-70。14 鲍蕾，刘心同，张艺兵，吕宁，检验检疫科学，2005，15（5），23-25。15郑荣，毛丹，王柯，季申. 药物分析杂志, 2005，25（6），610-613.
