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1、酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs发布时间：2009-11-08查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如 AccI ，A flIII ，AscI ，AvaI ，BamHI ，BglII ，BssHII ，BstEII ，BstXI ，ClaI ，E coRI ，HaeIII ，HindIII ，KpnI ，MluI ，NcoI ，NdeI ，NheI ，NotI ，N siI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII ， SalI ，ScaI ， SmaI ，S peI，SphI ，StuI ，X
2、baI ，XhoI ，XmaI ，为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定 的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位 点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计 PCR 引物时，人为的 在酶切位点序列的 5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高 将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点 往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边 的酶切位点切割。该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时， 最关心的应该是保护碱基的数 目，而不是种类。什么 样的酶切位点，添加
3、几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点， 是根据两条引物的 Tm 值和各引物的 碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加 G或C,反之亦反。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求， NEB 采 用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结 果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时）， 或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通 常需在识别位点两端至少加上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用Y-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A
4、2 60单位的寡核苷酸。取1pg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在2 0C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCI （pH 7.6）, 10 mM MgCI2 , 5 mMDTT 及适量的 NaCI 或 KCI （视酶的 具体要求而定）。 20%的 PAGE（7M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影 确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切 割效率则可能因为出现发夹结构而降低。酶寡核苷酸序列切割率2 hr20 hrAcc IGGTCGACC00CGGTCGACCG00CCGGTCGACCGG00Afl IIICACATGT
5、G00CCACATGTGG9090CCCACATGTGGG9090Asc IGGCGCGCC9090AGGCGCGCCT9090TTGGCGCGCCAA9090Ava ICCCCGGGG5090CCCCCGGGGG9090TCCCCCGGGGGA9090BamH ICGGATCCG1025CGGGATCCCG9090CGCGGATCCGCG9090Bgl IICAGATCTG00GAAGATCTTC7590GGAAGATCTTCC2590BssH IIGGCGCGCC00AGGCGCGCCT00TTGGCGCGCCAA5090BstE IIGGGT(A/T)ACCC010BstX IAACTG
6、CAGAACCAATGCATTGG00AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA2550CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT2590Cla ICATCGATG00GATCGATC00CCATCGATGG9090CCCATCGATGGG5050EcoR IGGAATTCC9090CGGAATTCCG9090CCGGAATTCCGG9090Hae IIIGGGGCCCCAGCGGCCGCT90909090TTGCGGCCGCAA9090HindIIICAAGCTTGKpn IMlu INco INde INhe INot INsi IPac IPme ICCAAGCTTGGC
7、CCAAGCTTGGGGGGTACCCGGGGTACCCCCGGGGTACCCCGGACGCGTCCGACGCGTCGCCCATGGGCATGCCATGGCATGCCATATGGCCCATATGGGCGCCATATGGCGGGGTTTCATATGAAACCCGGAATTCCATATGGAATTCCGGGAATTCCATATGGAATTCCCGGCTAGCCCGGCTAGCCGCTAGCTAGCTAGTTGCGGCCGCAAATTTGCGGCCGCTTTAAAATATGCGGCCGCTATAAAATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAA
8、ATGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTTTTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGGGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCC010759090909025505075757501010010102525109090900255001010909090900259002550AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG7590Pst IGCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAGAACCAATGCATTGG9090AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA9090CTGCAGAACCAATGC
9、ATTGGATGCAT00Pvu ICCGATCGG00ATCGATCGAT1025TCGCGATCGCGA010Sac ICGAGCTCG1010Sac IIGCCGCGGC00TCCCCGCGGGGA5090Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCG1050GACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA1075Sca IGAGTACTC1025AAAAGTACTTTT7575Sma ICCCGGG010CCCCGGGG010CCCCCGGGGG1050TCCCCCGGGGGA9090S
10、pe IGACTAGTC1090GGACTAGTCC1090CGGACTAGTCCG050CTAGACTAGTCTAG050Sph IGGCATGCC00CATGCATGCATG025ACATGCATGCATGT1050Stu IAAGGCCTT9090GAAGGCCTTC9090AAAAGGCCTTTT9090Xba ICTCTAGAG00GCTCTAGAGC9090TGCTCTAGAGCA7590CTAGTCTAGACTAG7590Xho ICCTCGAGG00CCCTCGAGGG1025CCGCTCGAGCGG1075Xma ICCCCGGGG00CCCCCGGGGG2575CCCCCCGGGGGG5090TCCCCCCGGGGGGA9090工注释：1如果要加在序列的 5端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 5端 加上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3端加保护碱基，就在酶切位 点识别碱基序列（红色）的 3 端加上相应的碱基（黑色）。2切割率：正确识别并酶切的效率3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
