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1、新生儿葡萄糖6磷酸脱氢酶（Neonatal G6PD）试剂盒使用说明书修订日期：2007.10产品编号：ND-1000【用途】本试剂盒用于定量测定采血滤纸片上血标本中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的浓度，以辅助筛查新生儿G6PD缺乏症。【测试简介和说明】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是一种临床上最常见的酶缺乏症。它是一种等位基因异常现象，以X染色体连锁的 隐性形式遗传下来。全世界约有2-4亿人患有G6PD缺乏症。本质上说，它是一种异质情况，并以男性居多，因为男性只有一 条 G6PD 拷贝，因此他们要么正常，要么异常。女性可以为正常、杂合体或纯合体，仅依靠表型很难区分。患有 G6P
2、D 缺乏 症的女性杂合体病人有一条正常 G6PD 合成的基因拷贝，和另一条产生变体酶的基因拷贝。正是由于这种双向合成使女性杂 合体病人有两种红细胞群体，一种正常，一种则缺乏G6PD。这就使杂合体女性的G6PD缺乏症很难得以诊断，因为正常红 细胞部分地掩盖了异常红细胞。这种掩盖发生时，女性 G6PD 缺乏症病人一般会产生比男性病人高的定量结果。根据G6PD变体的轻重程度，可将其分为四种：第一种是遗传性非球形红细胞溶血性贫血；第二种是G6PD严重缺乏症； 第三种是G6PD轻度缺乏症；第四种是缺乏性变体。G6PD缺乏症在美国的发生率为0.6-2.9%；中东高达26%；在台湾，男 性发病率为 4.5%
3、，女性为 2.7%。G6PD缺乏症患者对一些化学物质敏感，如抗疟疾药、6-氨基喹啉、蚕豆、磺胺类药物、一些感染、大剂量维生素C都能 引起溶血作用。因接触沉淀因子而致氧化应激的患者常表现为黄疸、疲劳、面色苍白、呼吸急促、嗜睡、心动过速和脾肿大。 对 G6PD 缺乏症的处理方法是避免接触沉淀因子。新生儿和幼儿患 G6PD 缺乏症尤其值得关注，因为未结合胆红素积累到一定程度时会导致脑核黄疸症，这种病是导致新 生儿智力迟钝和死亡的主要原因。第二种 G6PD 变体水平较高的新生儿的黄疸发生率明显高于其他群体，但是，一旦发现， 可通过光线疗法和苯巴比妥鲁米治疗进行预防。【测试原理】几乎所有的哺乳动物细胞中
4、都有G6PD，只是含量不同，它催化己糖单磷酸途径的第一阶段。测试中，通过血点样本中的 G6PD和伴随的NADP还原为NADPH的过程，葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）底物氧化成6-磷酸葡萄糖（6-PG）。在室温下使血点 样本和含有G-6-P及NADP的底物试剂反应30分钟。可加入硫酸铜使反应速度减慢。使用激发波长355nm和发射波长460nm， 进行荧光强度测量。下面是G6PD测试的反应过程概述，其中箭头上方的酶在血点样本中；G-6-P及NADP+在底物试剂中；其他物质均为反 应生成物。G6PDG-6-P + NADP+ 6-PG + NADPH* + H+（* =荧光素）【试剂盒成分】每一个新
5、生儿G6PD试剂盒含960人份试剂。试剂盒的有效期贴在外包装上在+2 - +8C条件下保存。成分数量保质期和储存条件G6PD calibrators （G6PD 定标品）1张滤纸卡（Whatman,903号）含5套冷藏保存，在原包装内防潮避光。+2 （近似值）干血点+8C条件下可保存到标签所示的失效A 0.2 U/g Hb期。确保储存期间塑料袋密封完好。B 1.7 U/g HbC 3.0 U/g HbD 5.0 U/g Hb精确的 G6PD 浓度请参考试剂盒中相应批号的质量控制证书。E 6.6 U/g HbF 7.8 U/g HbG6PD controls （G6PD 质控品）1张滤纸卡（Wh
6、atman,903号）含5套放在冰箱内，在原包装内保存，防潮避光。（近似值）干血点+2 +8C条件下可保存到瓶上标签所示正常 5.5 U/g Hb的失效期。异常 1 U/a Hb质控品的靶值请参考试剂盒中相应批号的质量控制证书。G6PD Substrate Reagent （G6PD 底物10小瓶，冻干+2 +8C条件下保存到瓶上标签所示的试剂）失效期。试剂含有B -烟酰胺腺嘌吟二核苷磷酸（NADP）,葡萄糖-6-磷酸和蔗糖。G6PD Reconstitution Buffer （G6PD复 1瓶，118mL+2+8C条件下保存到瓶上标签所示的溶缓冲液）失效期。备用的缓冲液含Tris-HCI、
7、氯化镁，用ProCiin 300作防腐剂。White microplates （白色微孔板） （未包被，96 孔）10板+2 +25CBarcode labels for the plate30份注意：条形码随批号改变。（微孔板条形码标签）Lot specific quality control certificate1份（和试剂盒批号匹配的质量控制证书）【试剂盒没有提供的其他必需品】新生儿 G6PD 试剂盒是由新生儿筛查试剂和仪器组成的完整系统的一部分。本系统需要的以下材料可以从 PerkinElmer Life and Analytical Sciences 公司或其代理商处购得。1. V
8、ictorTM2D荧光计1420-020型（无栈架）或1420-021型（带栈架）、打印机和电脑2. 自动打孔器-Wallac DBS Puncher （产品号 1296-071）或 Wallac MultiPuncherTM3产品号 1296-081）,或手动打孔器， 用来切割直径3.2mm（1/8 inch）的滤纸盘。3. 自动振荡器-DELFIA Plateshake （产品号 1296-003/004）除了需要DELFIA系统，还需要以下材料：8通道精确移液器，用于30-300uL容量移液或Apricot Sample Processor样品处理器（MS-550XD） 移液吸头振荡器/
9、混合器，用于混合G6PD底物试剂 用于测量 mL 容量试剂的移液器或带刻度量筒 试剂库用FDA批准的滤纸制成的标本卡【标本的采集和处理】由于本测试测量的是G6PD的酶活性，而不是代谢产物，因此可在婴儿出生后的任意时间内采血。血样应直接从足跟采集到滤纸片上。胆红素685umol/L和血红蛋白250g/L不影响测试。如果标本不直接采集到滤纸上（没选此方法），请勿使用含有EDTA或柠檬酸盐的管或毛细管采血，因为这些抗凝剂会和 铕标发生鳌合作用而影响测试。新生儿筛查程序有别于其他需要采集标本的程序。在美国，推荐的采血点是直径约为12.7mm （1/2英寸），用足跟采血法 并点到滤纸片上。通常是在出生后
10、2-6天内进行足跟采血。但是在其他一些筛查程序中，采样时间和数量可能不同。采样时间 和筛查标本的采集应符合当地相关规定。样本采样所用的器械必须符合FDA的规定。FDA通过的滤纸中，血清吸收性和hTSH 回收性随滤纸批号变化。但这不会引起总量化错误。干全血标本的采集方法需要熟练的标本收集、处理和运输技术。血标本收 集技术见NCCLS文件LA4-A4。此方法要点为：酒精棉签清洗局部皮肤后，风干。用消毒后的采血刀（或自动采血刀装置）刺入婴儿足跟部，入皮深度以1.0-2.0mm为宜。深过2.0mm易造成婴儿的骨 损伤。擦去最初流出的第一滴血，轻轻将滤纸贴附于随后流出的大滴血上，使得足量的血浸透浸满滤纸
11、上预先已经印好的圆圈。 此步骤应一次完成。检查滤纸的两面，确保血液已经渗透全层滤纸。挤压创口有可能导致标本发生溶血及组织液混入血标本内。 勿将随后渗出的血滴继续滴到滤纸收集环上（这样导致样品堆积成块）。血标本水平放置于室温下（+15 +22C），至少3小时使之风干。避免直接光照。在干燥过程中不要加热标本或把标本 叠放在一起。务必填充样品采集卡上所要求填写的信息。预先打印好的信息至少包括： 姓氏（名字，如有），性别、出生日期（可选：出生时间），出生时重量，幼儿年龄（出生时不足24小时的请注明） 和病人身份号码。母亲姓名标本采集日期（可选：采集时间） 提交人姓名和地址（可选：助产设施）医生姓名和电
12、话号码（保健提供者）新生儿筛查项目名称和地址每份卡都应有单独的系列号和有效期 在将标本装入容器运输之前，应该用物理屏障将采集卡上的干全血点与其上下层采血卡上的血点分开或旋转180度。 也可以用一块可折叠封盖或玻璃纸隔开样品来保护干血点。遵守当地关于包装和运输样品的邮寄和运输规定。标本不应放在密封的容器内（例如塑料或带箔片的袋子内）。如果 必须如此，一定要在袋中放入干燥剂。湿度和潮气对干血标本不利。采集后 24小时内运输或邮寄到实验室，或遵照筛查实验室的具体规定。有些筛查实验室可能会要求在采集卡上填写其他信息，如婴儿是否早产或超过预产日期出生，如果事实如此，则需提供早 产和迟产日期，是否是孪生，
13、有关喂养、可能的抗生素以及是否接受输血等信息。请咨询当地的法规和机构的政策，以了解样 本采集仪器所需要的最少信息。在可能的情况下，应将标本在+2 +8C条件下保存。室温下保存的血点标本，其G6PD的活性可能会大幅下降。标本到 达后应立即进行测试。失去G6PD活性的标本可能产生假阳性测试结果。注意：如果在标本采集后3-4周或更长时间才进行分析，血片很可能会在板孔中的溶液里漂浮起来。这种情况下的具体操作方法，请参见“操作注意事项”。【测试步骤】 定标品和质控品都要进行复孔测定。每块微孔板都应作定标曲线。未知样品可进行单次测定。使用前所有试剂和样本必须 恢复至室温（+20 +25C）。这一点对铜试剂
14、尤为重要，因其在低温时产生沉淀物。1、G6PD底物试剂+2+8C条件下稳定7天。在每个冻干的G6PD底物试剂小瓶中加入11mL的G6PD复溶缓冲液（配制后的溶液为1个微孔板用量），轻轻混匀。 注意：应该在使用前至少5分钟复溶G6PD底物试剂。2、使用自动或手动打孔器将滤纸盘打入板孔，并把打下的血点放在白色微孔板的板孔内。纸盘的直径约为3.2mm （1/8英寸）。 每块微孔板上都要有定标品和质控品，均为复孔。每个实验室可以自行决定质控品和样品的最佳排列位置。3、向每个装有滤纸片的板孔中加入100pL复溶G6PD底物试剂。不要让移液器接触到微孔板上的内容物。4、室温下孵育30分钟，用DELFIA
15、Plateshake振荡器慢速振荡。不要覆盖或叠放微孔板。5、如果需要，振荡铜试剂瓶，向试剂库中倒入21mL/板孔。应测量准确，防止浪费。在每个板孔中加入200pL。轻轻敲拍微 孔板使孔内溶液混匀。加入铜试剂后（15分钟）要马上读取。6、在VICTORtmD荧光计内测量荧光强度。在Start Wizard中开始测量，从Protocols/Kits面板“Neonatal USA中选择 “94G6PDS ”并定义微孔板和样品数。检查MultiCalc4操作步骤“94G6PDS”。如果改变了样品的复制数，也要相应地改变操作步骤（编辑参数见荧光计操作 手册或 MultiCalc 操作手册）。【操作注意事项】1、应充分理解本说明书以便顺利使用本新生儿试剂盒。试剂盒内的试剂作为一个整体使用。请不要将不同批号的试剂混用。 不要使用过期的试剂。2、任何与测试相违背的操作都可能影响测试结果。3、荧光数值可能随时间波动，但可以在每个微孔板中使用定标品以保持计算浓度稳定。4、漂浮的血点会产生假阳性结果。有漂浮血点的板孔的结果比板孔底部的血点结果低大约1-4 U/g Hb。加入铜试剂并敲拍微 孔板
