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1、精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 lncRNA芯片分析lncRNA芯片分析 修改时间2010/6/16 13:57:12 点击3210次 1. 归一化 lncRNA芯片采用的归一化的方法为quantile normalization。 2. 差异LncRNA的筛选 lncRNA芯片中既有lncRNA的探针又有mRNA的探针，分别做差异基因的筛选，筛选方法同表达谱的筛选方法是一致的，参见表达谱的差异基因筛选。 3. 差异lncRNA的重注释 lncRNA芯片注释不完善，因此需要将筛选出来的lncRNA进行重注释。将差异lncRNA在基因组上位置上下游延伸，以寻找lncRNA附近的
2、有功能的基因。 差异lncRNA重注释示例 4. 差异lncRNA靶基因的预测 lncRNA可能通过调控相应的mRNA发挥功能，因此有必要预测lncRNA的靶基因。我们提取差异lncRNA和mRNA的序列，首先用blast进行初筛，之后用RNAplex进行进一步筛选，以预测lncRNA可能调控的mRNA。 差异lncRNA靶基因预测结果示例 5. 差异lncRNA与靶基因共表达网络 预测出lncRNA的靶基因后，并可进一步在mRNA的数据中探寻该mRNA是否发生表达量的变化。由此构建差异lncRNA与靶基因相互作用网络图。 差异lncRNA与靶基因相互作用网络图。方框代表lncRNA，圆形代表
3、mRNA。连线表示可能的调控关系。节点面积越大，表示调控的mRNA越多，预示该lncRNA在调控网络中所起的作用可能越大。 6. 差异lncRNA与差异mRNA的共表达分析 SBC Human lncRNA芯片能同时检测出差异表达的lncRNA和mRNA。我们将差异lncRNA和差异mRNA在一组样品中进行共表达分析，可以发现与某个lncRNA具有相同表达模式的mRNA。 要求：每组数据3个或3个以上生物学重复 实验组： 对照组： lncRNA与mRNA共表达分析作用图，圆形带圈代表lncRNA，圆形代表mRNA。红色为上调基因，绿色为下调基因。 7. 差异lncRNA靶基因的GO analy
4、sis 对lncRNA的靶基因进行GO Ontology的生物学的分类，根据Fishers Exact Test,得到p-value，得到lncRNA靶基因对应的显著性功能，从而了解lncRNA的功能。 8. 差异lncRNA靶基因的pathway analysis 对lncRNA靶基因按照Pathway的主要公共数据库KEGG和Biocarta来进行分类，对Pathway中的基因进行基于离散分布的显著性分析，得到与实验目的有显著联系的Pathway 分类,由这些pathway对应相应的靶基因，从而获得该分类即导致lncRNA差异的最重要Pathway。 9. 差异lncRNA的转录因子的预测
5、 提取lncRNA TSS的上游2000bp，下游500bp,利用HMM的算法根据TRANSFAC8.1数据库预测其转录因子。 1) 芯片数据预处理：对实验数据质量评估，预处理及均一化处理。2) 差异表达lncRNA及mRNA 的筛选：根据客户提供样本量的大小与分布或实验目的，应用倍数法、多重假设检验等手段，对两条件或多条件下的表达差异的lncRNA和mRNA分别进行计算和筛选。 表达模式聚类分析：针对芯片结果进行样本及差异表达lncRNA和mRNA的聚类，寻找属于同一表达趋势的基因或样本。 GO和pathway显著性富集分析：差异基因，应用数据库进行功能富集分析，挖掘具有统计学意义的差异表达
6、基因的功能类别。显著性P值越小，则它随机聚集差异表达基因的概率越小，其功能相关性的非随机性就越小，该功能模块有较大的可能与疾病（或药物作用） 相关。 蛋白互作网络分析：研究与指定蛋白质相互作用的其他蛋白质的信息，以使研究人员能够更加深入地认清相关蛋白质的功能，更清楚地理解其调控机制。3) lncRNA-mRNA共表达分析：对于每一个差异表达的lncRNAs，计算得到与之共表达的编码基因。4) lncRNA表达模式分析：考察差异表达LncRNAs 的表达模式，将LncRNAs 以及与该LncRNAs 显著共表达的编码基因的表达模式绘制heatmap。5) lncRNA功能预测：筛选出表达显著相关
7、的lncRNA-mRNA 关系对，利用成熟的mRNA 的功能来推导lncRNA 的功能，对异常表达lncRNA 显著相关的mRNA 进行功能富集分析。6) lncRNA cis作用机制研究：对于感兴趣的差异表达lncRNAs，搜索其上下游100K范围内的所有编码基因，并与该lncRNAs 有显著共表达的基因取交集。这些在基因组上临近、且表达模式上共表达的基因很可能被该lncRNAs 所调控。7) lncRNA trans作用机制研究：计算LncRNAs 共表达的编码基因，集合与转录因子/染色质调控复合物的靶基因集合的交集，利用超几何分布计算该交集的富集程度，得到与lncRNAs 显著相关的转录
8、因子，从而识别可能与lncRNAs 联合发挥调控作用的转录因子/染色质调控因子。 lncRNA-转录因子二元关系及网络分析 lncRNA-转录因子-靶基因三元关系及网络分析综述长链非编码RNA（lncRNA）来源: 新药筛选中心 /点击: 1464lncRNA长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类不编码蛋白的RNA 分子，长度在200bp 以上，起初被认为是RNA 聚合酶II 转录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA 具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA 和RNA 相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，
9、如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA 的诱导分子干扰基因的表达等。随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA 被注释，但是绝大多数的lncRNA 的功能仍然不清楚，因此lncRNA 的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。lncRNA介绍长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明lncRNA能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达，参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转
10、录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联系。为何细胞不惜耗费能量对这些非编码RNA的表达和定位进行严格调控呢？这些RNA分析究竟有何功能？RNA测序技术的发展使人们得以初窥这一神秘分子，现在lncRNA的许多相关信息都可以再新数据库中查到，例如Broad研究所、哈佛大学和麻省理工共同开发的Human Body Map lincRNAs catalog。虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是现在人们了解到的lncRNA只是冰山一角，绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。随着研究的推进，各类lncRNA的大量发现，lncRNA的研究作为
11、RNA研究的新领域，已经成为一个非常吸引人的方向，有待广大科学家去探寻。lncRNA研究当前面临的一个主要挑战是，研究工具还在不断开发和改进中，而lncRNA研究中非常关键的一步就是发现与特定疾病相关的lncRNA。现阶段，基因芯片技术发展趋于成熟稳定，在此平台上，通过设计不同检测lncRNA探针筛选lncRNA是一种准确快捷的方法。lncRNA特征lncRNA通常较长，具有mRNA样结构，有些具有poly(A)尾巴，有些没有poly(A)尾巴，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式，与编码基因相比，lncRNA表达量更低。 组织特异性：不同组织之间的lncRNA表达量不同。 时空特异性：同一
12、组织或器官的不同生长阶段，其中的lncRNA表达量也会变化。 lncRNA启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4，Nanog，CREB，Sp1，c-myc，Sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征。 大多数的lncRNA在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性，如有人针对小鼠的1300个lncRNA进行研究，发现在脑组织中的不同部位，lncRNA具有不同的表达模式。 在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式。 lncRNA的亚细胞位置上也呈多样化，在细胞核、细胞质和细胞器均有分布，甚至某些lncRNA具有独特的亚细胞位置，有可能是全新的亚细胞构成。lncRN
13、A功能lncRNA可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现对基因表达的调控：a) lncRNA通过招募染色质重塑复合物至特定的基因组位点使其发生催化活性。如HOTAIR21，Xist、RepA和Kcnqot1招募Polycomb complex至HoxD位点，使得X染色体或Kcnq1功能域的组蛋白H3 第27位赖氨酸发生3甲基化（me3K27），诱导异染色质形成，从而抑制该区域基因表达。b) lncRNA通过多种机制进行转录水平调控。lncRNA结合到基因cyclin D1上，招募RNA结合蛋白TLS来调控蛋白CBP和p300的组蛋白乙酰转移酶活性，进而抑制cyclin D1转录。c
14、) 超保守增强子转录出lncRNA-Evf2，该lncRNA能激活转录因子DLX2，进而调控基因Dlx6转录。d) DHFR次要启动子区域转录出的lncRNA与该基因主要启动子区域结合形成三聚体，抑制转录因子TFIID结合，从而使基因DHFR发生沉默。e) 反义lncRNA能够与剪接体（splicesome）中锌指同源mRNA Zeb2的5剪切位点结合，使内含子未被剪切掉，而该内含子序列中保留有内部核糖体进入位点（IRE位点），翻译过程中识别并结合该位点，导致Zeb2基因表达和翻译。lncRNA分子机制随着lncRNA功能逐步显现，其与靶点的作用机制成为进一步的热点。早期认为原位调控是LncR
15、NA作用的唯一机制，它通过招募形成染色质修饰复合物而沉默邻近基因转录，例如IGF2R反义RNA(antisense of IGF2RRNA，AIR)、XIST等。而Hox基因反义基因间RNA(Hox antisense intergenic RNA，HOTAIR)的发现提示LncRNA可能存在远程调控。同源异型基因(homeotic genes，HOX)在细胞增殖与定向分化中起关键作用，人类Hox基因簇约含100个ncRNA基因，其中HOTAIR定位于HOXC基因座12q13.13。HOTAIR的5端可招募结合多梳蛋白抑制复合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)，借助PRC2上三个H3K27甲基化酶EZH2、SUZ12和EED，使另一基因座HOXD上长约40kb的序列转录沉默，从而在乳腺上皮细胞内使细胞内转录倾向于胚胎成纤维细胞样表型。超过20%的LncRNA能够通过结合PRC2或其他类似复合物发挥作用，提示LncRNA的远程调控机制在生物体内广泛存在。其作用机制如下图所示，主要包括以下几种情况：1) 在编码蛋白基因的上游启动
