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1、CoImmunoprecipitationPart I: prepare sample预冷PBS, Lysis Buffer，细胞刮子，离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS （斜放控干）；2. 加入预冷的lysis Buffer （加PMSF, Proteinase cocktail，用量视细胞数而定）， 冰上裂解10 min。3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4C4. MSC: 4C，12000rpm 离心 15min，取上清。Cancer cells :超声裂解（操作见附件），4C，12000rpm离心15min，取上清。5. PB
2、S 洗两遍 Protein A agarose 珠子（先静置，3000rpm， 1min），用 PBS 配制 成50%浓度（减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠）。6. Sample预处理：每1ml总蛋白中加入100 Protein A琼脂糖珠（50%），4C 12 rpm转盘，10min （去除非特异性杂蛋白，降低背景）。7. 4C静置，3000rpm， 1min，取上清，去除Protein A珠子8. （Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1 ： 10 倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20C保存一 个月）9.
3、用PBS将总蛋白稀释到约 顷g/皿 以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣 蛋白在细胞中含量较低则总蛋白浓度应该稍高（如10曜何）10. 加入一定体积 antibody（eg ：IgG，Kindlin2）到 beads 中，4C, 12 rpm 转盘， 2h。11. 加入 sample 到 beads， 4C, 12 rpm 转盘，过夜。12. 4 C静置，3000rpm，5min，弃上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，用预冷的PBS洗3遍，1ml/遍，最后一遍用lysis buffer.o 13.加5*SDS Buffer,煮10 min，离心，将上清电泳。Lysis buffer :Q9e止
4、 NQQml-20mM Tis-Hl （PH 7.4） 1M 10ml4mlISDmWLJ如Gh 5M 15ml6ml -ImM - - EDTAD.5M 1ml0.4ml1mM -EGTAC.25M 2ml （S 0.19gJ 0.076gp1% - Triton 5ml2ml+J2.5mM Sodium pyrophosphate Na4P2O7 cm&i Q.125Mb-gdyjEfeTflUllKSPhate C3H7O6 PNa20.108g 0.0432“ImM5攻皿朗|1戏05曲血 Na3VO4 - cmm -Q.2M补加1 mM PMSF （若仅作IP,可加0.05% SDS）如伽）.加 10%甘油（保护蛋白 complex 结构），用前加 PMSF, proteinase cocktail.超声：先加冰水混合物降温，放样品，程序如图：叩口舟WM SJ rifNGS PSg-RAIM ff踮泊队网网地30
