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1、新城疫的血凝和血凝克制试验高若开一、实验目的1. 掌握血凝和血凝克制试验的基来源理、操作方法和结果判断方法。2. 剖析血凝和血凝克制试验的影响要素，用以确立最正确免疫时间、判断免疫成效和协助疾病诊疗。二、实验内容1. 血凝试验（HA）检测新城疫抗原2. 血凝克制试验（HI）检测新城疫抗体实验原理病毒颗粒I am late1. 血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝聚，这类 凝聚红细胞的现象称为血凝（ HA）,也称直接血凝反响。e红细胞2. 血凝克制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这类抗体的量足以克制病毒颗 粒或其血凝素时，则红细胞
2、表面的受体就不可以与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝聚现 象就被克制，称为红细胞凝聚克制（HI ）反响，也称血凝克制反响。抗原抗体四、实验资料离心计、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100 （若微升可调）、吸液尖 干）、洗耳球、离心试管、一般试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。1毫升抗凝剂可用于收集 9毫升血液。（二）10%红细胞悬液的配制1、 用注射器汲取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。2、1500转离心5分
3、钟，吸弃上清液。3、用5-10倍生理盐水1500转清洗3次，前两次 5分钟，后一次10分钟。4、吸弃上清液，用吸量管汲取红细胞，配制成10%红细胞悬液。5、2-6摄氏度储藏，备用。（三）血凝试验（HA）1. 在血凝板上第一排的 1 12孔内各加入50ul生理盐水2. 将系苗用生理盐水 5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，而后挨次倍比稀释至第11孑L,最后弃50ul。3. 每孔加入1 %鸡红细胞悬液50ul4. 轻轻振荡均匀，后放于室温或37C中静置 30分钟5. 结果判断 血凝效价测定1234567891011122 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X 256 X 512
4、 X 1024 X 204；X红细1胞比较生理盐水505050505050505050505050抗原5050505050505050505050弃50红细胞5105050505050505050505050结果+ + + + + + + + + + +结果判断标准1、 + + + + :红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 %凝聚；2、 + + + ：红细胞均匀铺于孔底，当边沿不齐整而稍向孔底集中，即75 %凝聚；3、+ :红细胞形成一个环状，周围有凝聚块，即 50 %凝聚；4、 + :红细胞于孔底形成圆团，边沿不够圆滑，周围稍有凝聚块，即25 %凝聚；5、一：红细胞于孔底形成圆团，边沿圆滑
5、齐整，即无凝聚。血凝价的判断以100%凝聚的病毒最大稀释度为该病毒的血凝价，即为一个凝聚单位。上表看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:32，则1:32为1个血凝单位，1:16、1:8分别为2、4个血凝单位，或将32/4=8 ,即1:8稀释的病毒液为4个血凝单位。（四）4个血凝单位抗原的配制依据判断结果，汲取 1毫升已稀释的病原溶液再以8倍稀释，即为4个血凝单位的标准抗原。（五）血凝克制试验1、 在血凝板上1 12孔内各加入50ul生理盐水；2、 在第1孔内加入被检血清50ul，而后倍比稀释至第11孔，最后弃50ul ；3、第1 12孔内加入 4单位抗原50ul （第12孔为病毒比较）；4、每孔加
6、入1 %鸡红细胞悬液 50ul ；5、 轻轻振荡均匀，后放于室温或37 C中静置30分钟6、结果判断血凝克制效价测定1234567891011122 X4 X8 X16 X32 X64 X128 X 256 X 512 X 1024 X 204!IX病卡1比较生理 盐水505050505050505050505050血清5050505050505050505050弃504单位5（抗原I5050505050505050505050红细胞505050505050505050505050结果一-：+ + + + -+- + + + -+ + + + + + -+ + + - + + + -+ +结果
7、判断标准1、 + + + + :红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 %凝聚；2、 + + + ：红细胞均匀铺于孔底，当边沿不齐整而稍向孔底集中，即75 %凝聚；3、+ :红细胞形成一个环状，周围有凝聚块，即 50 %凝聚；4、 + :红细胞于孔底形成圆团，边沿不够圆滑，周围稍有凝聚块，即25 %凝聚;5、一：红细胞于孔底形成圆团，边沿圆滑齐整，即无凝聚。血凝克制价的判断将反响板倾斜成 45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为积淀，表示红细胞未被或不完整被病毒凝聚；假如孔底的红细胞摊平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说2为底的对数（10g2）表示。如上例,明红细胞被病毒所
8、凝聚。能将4单位病毒物质凝聚红细胞的作用完整克制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝聚克制效价，用被检血清的稀释倍数或以该血清的红细胞凝聚克制效价为1: 4或HI效价为2（10g2）。稀释 2 X倍数结果8 X+16 X32 X64 X128 X256 X512 X1024 2048 X血清 比较+ + + + + + + + + + + + + +结果剖析：在比较出现正确结果的状况下，已完整克制红细胞凝聚的最大稀释度为该血清的血凝克 制滴度。(1) 一般以为鸡的免疫临界水平为1:8(成年)或1:16(雏鸡)，随处区不一样而稍有差别。(2) 鸡血清HI抗体效价高于 1:16时可适合推延新城
9、疫免疫的时间，HI抗体效价在1:16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地域或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提升。(3) 鸡群的HI抗体水平(血凝克制滴度)是以抽检样品的HI抗体效价(log 2)的几何均匀值表示的。假如某鸡群的10份样品中，HI抗体效价(log 2)为8的有3份样品，为7的有5份样品，为6的有2份样品，它们的均匀值为：(8 X 3 + 7 X 5 + 6 X 2 ) / ( 3 +5 + 2 ) = 7.1均匀水平在4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。则不可以用上法计算均匀水应依据临界水平，0.1 % 0.5 %，小型鸡群，抽样率应有若在检样中HI抗体效价的最高值与
10、最低值相差太大时， 平以下的样品数在所有样品中所占的百分比决定免疫与否。(4) 大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于所增添，一般以为理想的抽样率应为2.0 %。(5) 鸡群接种新城疫疫苗后，经23周测血清中的HI抗体效价，若提升2个滴度以上，表示鸡 的免疫应答优秀，疫苗接种成功；若HI抗体效价无显然提升，表示免疫失败。(6) 如有10%以上的鸡群出现11(10g2)以上的高血凝克制滴度，说明鸡群已受新城疫强毒感染。若监测鸡群的免疫水平，用血凝克制滴度在4(10g2)的鸡群保护率为50%左右；在4(10g2)以上保护 率达90-100% ；在4(10g2)以下的非免疫鸡群保护率约9%，免疫过的鸡群为43%。六、注意事项1、红细胞用前请摇匀。2、用枪加样定要正确，尽量不要有气泡。3、结果判断要有耐心。4、HA和HI勿相混。【$
