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1、实验八凝集试验目的要求1. 熟悉平板凝集反应和试管凝集反应的操作技术，通过对凝集结果的观察和记录，了 解凝集的判定和对被检牲畜试验结果的判定。2. 了解间接血凝反应试验过程和操作方法。操作步骤一、平板凝集反应（以布氏杆菌为例）（一）取洁净玻片一块，用玻璃铅笔划成五行小格，并标明待检血清的号码。（三）按表8-1滴加待检血清、抗原（将牛、羊、猪三型布氏杆菌悬浮于甘油浓盐水中， 加入煌绿及结晶紫制成）和生理盐水（检查绵羊、山羊血清时，用12%浓盐水）。血清用前 需放室温，使其温度达20C左右。表8-1布氏杆菌的平板凝集反应成分试验组对照1234盐 水0.03被检血清0.080.040.020.01抗
2、 原0.030.030.030.030.03（三）用火柴棒自血清量最少格起，依次往前搅拌，使血清与抗原混匀，每份血清用一 根火柴棒。（四）混合完毕后，将玻片置于凝集反应箱上均匀加温，或放于离火焰稍高处，微微加 温至30C左右，35分钟内记录反应结果。（五）按下列标准记录反应强度+:出现大的凝集块、液体完全透明。+：有明显凝集块、液体几乎完全透明，即75%凝集。+：有可见凝集片，液体不甚透明，即50%凝集。+：液体混浊，有小的颗粒状物，即25%凝集。：液体均匀混浊，无凝集物。牛、马和骆驼的血清在0.02ml处或以上凝集，而绵羊、山羊和猪的血清在0.04ml处或 以上凝集，判为阳性反应；牛、马和骆
3、驼的血清在0.04ml处凝集，绵羊、山羊和猪的血清 在0.08ml处凝集时判为可疑反应。大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用0.04和0.02ml，猪、山 羊和绵羊、狗用0.08和0.04ml。如用两个血清量作试验，任何一个血清量出现凝集时，均 需用四个血清量重检。（六）每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。二、试管凝集反应（一）每份血清用4支试管（1X8cm），另取对照管3支。如待检血清多时，只设一份 对照组。（二）按表8-2，用0.5%石炭酸生理盐水，将被检血清稀释成四个稀释度。第五管中 不加血清，设抗原对照。第六管中加1： 25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5毫升作阳性
4、对照。 第七管中加1： 25稀释的布氏杆菌阴性血清0.5毫升作阴性对照。（三）各管中加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释20倍的布氏杆菌抗原0.5ml （每ml含 菌8亿）。（四）各管加抗原后，将各管充分混匀，放37温箱中感作410小时，取出后放室 温1824小时，然后观察并记录结果。（五）检查猪、羊、狗时血清稀释度为1:25，1:50，1:100，1:200；绵羊、山羊血清 用10%浓盐水稀释。牛、马和驼骆血清稀释度为1:50，1:100，1:200，1:400，大规模检疫 可只用两个稀释度，即狗、猪、羊为1:25，1:50；牛、马、骆驼为1:50和1:100。判定结果时用“十”表示反应强度：+
5、：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块 状或颗粒状（即100%的菌体被凝集）。+：液体略混浊，菌体大部分被凝集于管底，振荡时呈片状或颗粒状（75%菌体被凝 集）。+：液体不透明，管底有明显凝集片，振荡时有块状或小片絮状物（50%菌体被凝集）。+：液体不透明，仅管底有少许凝集，其余无显著的凝集块（25%菌体被凝集）。：液体混浊，管底无凝集，菌体不被凝集，但由于菌体自然下沉，在管底中央可见圆 点状沉淀，振荡后立即散开呈均匀混浊。表8-2投:一灼汶片苣抗原0.50.50*50.50.50,5弃去LS弃去（六）当每份待检血清仅用2个稀释度进行试验时，无论任何一个稀释度发
6、生凝集现象， 该血清都应该用四个稀释度重检。（七）判定血清凝集价：出现+”以上凝集现象的最高血清稀释度为凝集价。牛、马 和骆驼血清凝集价1:100以上为阳性，1:50为可疑。猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价为 1:50以上为阳性，1:25可疑。三、间接血球凝集试验（以结核病为例）（一）致敏红血球的制备1. 无菌采取绵羊血于阿氏液中，于4C冰箱保存备用（保存期3周）。用时用生理盐水洗 涤3次。2. 用pH7.4PBS稀释旧结核菌素1560倍，每6毫升稀释的结核菌素加沉淀血清0.1 毫升。混合后置37C水浴2小时，每15分钟振摇1次，以防血球沉降。3 .用生理盐水洗涤致敏红血球3次后稀释成0.25%
7、血球悬液。（二）间接凝集反应：1.取被检血清1毫升加等量洗涤后的沉积红血球，室温作用10分钟后，离心除去红血 球，以吸收非特异性凝集素。56C灭活30分钟。2. 按表8-3分别加入各种成分。8-3结核病间接红血球俊集试验成分12345673910抗原对照血活对胆生理盐水(ml)件105 5)50.50.25被橙血活(ml)0.5C 0.5L 0.5L % L0.5 -* 0.5 L* 0.5 匚0.5 75 -* 0.5 0.250.25% Si Si 血球(血)0.10.10.10.10.10.10.1振激昆色于2尸敢置过夜0.10.10.10.1未浦 血球0.11弃去D.53. 按管底血球沉降图形判定凝集程度。血球凝集于管底呈伞状，轻轻振荡后血球呈颗 粒状或絮片状者为+ ；血球集中沉淀于管底呈小园点，轻摇后呈均匀混浊者为一；介于二 者之间的判为+和+。本法诊断结核病有特异性，可诊断活动性结核。如多次检查凝集价显著升高者(升高4 倍以上)，可判为活动性结核。
