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1、代谢工程中一个乳酸菌双乳酸脱氢酶敲除以提高乙醇的产量摘要乳酸菌通过Embden-迈耶霍夫-帕纳斯（EMP途径发酵葡萄糖：中间代谢 物丙酮酸通过乳酸脱氢酶（LDH的作用转化为乳酸。用丙酮酸脱羧酶（PDC）取代 乳酸脱氢酶（LDH）对丙酮酸进行催化作用,可以使丙酮酸生成乙醇从而代替乳酸 的产生。将一个革兰氏阳性菌一一胃八叠球菌（Spdc）的丙酮酸脱羧酶（PDC）基 因引入到一个植物乳杆菌TF103乳酸脱氢酶缺陷型菌株中，使其中ldhL和ldhD 基因失活。在胃八叠球菌和S. ven triculi（种菌株）启动子或三个乳酸乳球菌启动子中的四个不同的融合基因中的pTRKH2（厌氧靶向自杀基因）被引入
2、到TF103中。检测所有四个重组株的丙酮酸脱羧酶 （PDC）的活性。通过对工程菌生 产乙醇和其他代谢产物在烧瓶中的发酵来检验工程菌。重组菌株的生长略快于亲 代TF103并且生产90130毫米的乙醇。虽然产生的略多的乙醇是明显的， 但 是碳元素向乙醇代谢的途径并没有得到显著改善，因此建议进一步了解了这个有 机体的新陈代谢是必要的。关键字：乙醇发酵；代谢工程；乳酸菌；丙酮酸脱羧酶；胃八叠球菌（SPDC正文介绍乳酸菌是一类兼性厌氧的革兰氏阳性菌。乳酸菌通常缺乏呼吸链，它们利用 发酵产生的一系列糖类来提供能量用于细胞的维护和生长。 在乳酸菌的 发酵中， 乳酸是发酵的终产物，而在异型乳酸发酵细菌 的发酵
3、中，通常戊糖通过磷酸乙酮 醇酶途径 （PPT途径）产生的是乙醇、二氧化碳、醋酸和乳酸的混合物。乳酸菌一般被认为是安全的，天然的乳酸菌已经被应用于发酵工业中。 近年 来，人们研究基因改造乳酸菌用于生产乳酸、B族维生素、低热量糖醇如山梨醇和甘露醇。乳酸菌可以在较低的 pH值条件下生长，并且很多菌株是耐乙醇的。 这些特点都有助于开发新的微生物用于发酵木质纤维素生物质生产乙醇。将纤维素转化为乙醇，要求微生物能够，发酵从水解木质纤维素生物质中释放出来的葡 萄糖和木糖糖类。许多乳酸菌可以代谢多糖，包括戊糖。因此，对于代谢工程中 的生物质生产乙醇来说，它们似乎是理想的宿主。但是，乳酸菌不会生产大量的乙醇，因
4、为它们会将糖发酵成乳酸。 本实验研究的目的在于， 利用植物乳杆菌作 为模式菌株，用于探索使其从产生乳酸转而产生乙醇的能力的可能性。负责使丙酮酸产生乙醇的酶有丙酮酸脱羧酶（ PDC;EC4.1.1.1 ）和乙醇脱氢 酶（ADH; EC 1.1.1.1）。丙酮酸脱羧酶（PDC ）催化丙酮酸脱羧产生乙醛和二氧 化碳，然后乙醛通过乙醇脱氢酶催化变为乙醇。 Mobilis 的运动发酵单胞菌中生 产乙醇的基因 pdc 和 adh 被整合在一个 便携式的 pet 操纵子 中。理论上，将 pet 操纵子引入到大肠杆菌中，乙醇的收益率可能在8692%。pet 操纵子也被引入到革兰氏阳性菌和乳酸菌菌株中。这些重组
5、的菌株很少 或者不能产乙醇，这表明源于革兰氏阴性菌的 pdc 基因不能在革兰氏阳性菌中 发挥适当的功能。 这可能是由于革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌种类之间对于密码子 的偏好性和 /或基因表达的显著差异所造成的。与普遍存在于许多生物包括细菌中的乙醇脱氢酶 （ADH）不同，虽然丙酮酸脱 羧酶（PDC）广泛的分布在植物中，但是它们只能在少数种类的细菌中才能被 找到。最近才得到描述的在革兰氏阳性菌中仅有的 pdc 基因来自于 胃八叠球菌 （SPDC） 。在酸性条件下 （pH 3.0）, S.ventriculi 利用丙酮酸脱羧酶（ PDC） 使碳元素和电子的流向从流向醋酸、甲酸、和乙醇改变为主要流向乙醇。
6、S.ventriculi的丙酮酸脱羧酶（PDC）是被丙酮酸激活的并且符合 S形动力学，类似真菌和高等植物的酶符合米氏动力学。 这种革兰氏阳性菌 Spdc 基因中 G+C 密码子的低频率使用，为革兰氏阳性菌工程宿主对于丙酮酸脱羧酶（PDC ）高水平的表达和开发第二代可以使用生物质糖产乙醇的微生物提供了可能。 本文的 目的是确定革兰氏阳性菌胃八叠球菌（Spdc）可以在植物乳杆菌中功能性表达，并且测试是否有一种乳酸缺陷型的植物乳杆菌菌株能够被采用主要用来发酵 生产乙醇。材料与方法菌株与生长条件Goodwin和Zeikus如上述在厌氧条件下培养 S. ventriculi JK 。Ferain博 士提
7、供了植物乳杆菌NCIMB8826厅生株TF1O3 TF103菌株是D型和L型乳酸脱 氢酶活性的缺陷型菌株，培养在 37C、100rpm（转/每分钟）添加了氯霉素（10 卩g/ml）或红霉素（5卩g/ml）MRS液体培养基中。大肠杆菌DH5x，BL21（ DE3 pLysS（Invitrogen 公司，卡尔斯巴德，CA）,和 BL21- CodonPlus- RIL （Stratagene 公司，拉霍亚，CA）生长在37C,BHI或Luria - Bertani中，需要时可向培养基 中加红霉素（150卩g/ml），或氨苄青霉素（50卩g/ml）或氯霉素（35卩g/ml）。Table 1 Olig
8、onucleotides used in this studyM13 ReverseCAGGAAACAGCTATGACT7 PromoterSpdc5CXbalSpdc3CXhol Spdc5CATG BamHI Spdc 3 0pnlSpdc 3 0431Amj5CEcoRVAmj30XbaITAATACGACTCACTATAGGGGGCTTCTAGATAAAAAATGAATTGGAGGGCGGGCTCGAGATTAGTAGTTATTTTGGCCGGATCCATGAAAATAACAATTGCAGGCCGGTACCATTAGTAGTTATTTTGTCTGCTGCATATCCTGCAACCGAT
9、ATCATTTTTGGTTGCCATTTGTTCCTCTAGACTAGACAACAAAATAG将胃八叠球菌（Spdc）克隆到pBluescript （原核表达载体）和pTRKH2大 肠杆菌穿梭质粒 ）使用 Bactozol 试剂盒（分子研究中心，俄亥俄州辛辛那提）从 S. ventriculi 中分离染色体DNA按照制造商所描述的拟定方法，额外用氯仿抽提。PCR以 S.ventriculi 基因组 DNA为模板，Spdc50XbaI 和 Spdc30XhoI 为引物（表 1）， 从Gen ba nk中获得其储存的序列 AF354297并且这一序列引物的末端具有 XbaI and XhoI位点。
10、从基因组DNA中扩增出1.7kb的全长Spdc基因，然后进行纯化、 消化，并且克隆到pBluescript SK 载体以及穿梭载体pTRKH2勺XbaI and XhoI 位点以获得pTRKH2 Spdc重组子。Sambrook等将用到的标准的分子生物学技术 进行了描述。用Qiaprep自旋试剂盒（Qiagen公司，瓦伦西亚，CA进行大肠 杆菌的质粒DNA的纯化制备。根据 O Sullivan 和Klaenhammer，从植物乳杆 菌菌株中分离质粒。如上所诉，完成 DNA的测序和数据分析。在大肠杆菌中表达 SpdcPCF引物Spdc5z端的ATGBamHI酶切位点和Spdc3z端的Kpnl酶切
11、位点用 于扩增Spdc基因并且将其克隆到pRSETa（BamHI/Kpnl）载体中。由此产生的pRSET-Spd（用来转化大肠杆菌 BL21 （DE3，pLysS,和 BL21 - CodonPlus-RIL。 在体内，根据供应商指示进行了 IPTG （异丙基-BD-半乳糖苷）诱导和表达。细 胞颗粒的裂解使用CelLytic B+试剂盒（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州）。约 10卩g可溶及不可溶的蛋白提取物（重悬于 50卩g磷酸盐缓冲液），进行12.5 % 的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。为了提高过量表达的蛋白质的溶解度，在 10ml稀 释的TB培养基中过夜培养，培养基中含有不同浓度 （0,
12、200, and 500 mM）的甘 氨酸（Sigma公司），培养在37C、OD=1的条件下。在 0.5 mM IPTG、27C的 条件下进行 14-16 小时的蛋白质表达的诱导。在植物乳杆菌TF103中表达Spdc革兰氏阳性启动子-SPDC的融合构造如下。在pAK80中，以克隆质粒AMJ772 AMJ769和AMJ692所含有三个乳酸启动子作为模板扩增 118 bp的启动子序列， 引物为Amj5z EcoRV和Amj3z Xbal位。这些启动子序列被克隆到 pTR KH2 Spdc 的 EcoRI/XbaI 位点，分别生成 pTRKH2 772Spdc, pTRKH2 769Spdc, 和
13、pTRKH2 692Spda上述的这些结构通过电转化被转入到植入乳杆菌TF103,重组子通过红霉素筛选获得。丙酮酸脱羧酶检测如前所述，需进行丙酮酸脱羧酶（PDC ）活性的检测。简言之，培养的含 有SPDC融合基因的重组大肠杆菌和植物乳杆菌 TF103细胞在含有2 mM（毫摩） TPP和 20m（毫摩）硫酸镁的50 mM磷酸钠缓冲液（pH值6.5 ）使用beadbeater 研磨珠均质器（Biospec产品，巴特尔斯维尔，OK进行溶解。使用BIO RAD蛋 白测定试剂盒（BIO-RAD实验室，大力士，CA对蛋白浓度进行测定。将 蛋白提 取物（150 - 250卩g/ml）加入到含有30 mM （
14、毫摩）乙醛，40 mM （毫摩）甲醛，2 mM（毫摩）TPP和 20 mM （毫摩）硫酸镁的50 mM （毫摩）磷酸钠缓冲液（pH值 6.5 ）中，定容至500卩l，并在25E下培养30分钟。向反应混合物的上清中加 入含0.2 %的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（甲醇溶解）和10卩l 3M的氢氧化钠（最 终130 mM（毫摩）的四氮唑红20卩l，然后进行（R） - PAC的检测。形成甲臜（大肠菌群在发育时伴随产生琥珀酸脱氢酶将纸片上的TTC（红四碳唑）还原成不可逆的甲臜（Formazan产生红色色素）的数量分光光度计在510 nm处进行测 定。1分钟1毫克蛋白质形成I卩mol的甲臜即为具体的一个
15、单位 PDC舌性。工程菌株TF103的发酵利用摇瓶发酵对产乙醇的重组植物乳杆菌 TF103菌株进行评估。如上所诉， 用加红霉素的4%葡萄糖MRS培养基进行重复发酵。发酵时间在 72小时至240 小时之间时，每隔一段时间取出一些样品。 残余的葡萄糖和发酵产物， 包括乳酸， 醋酸和乙醇的浓度， 利用高效液相色谱进行测定。 通过两个实验获得的数据计算 代谢产量（g乙醇/g葡萄糖），并且通过反复发酵分析其它发酵产物的产生。结果SPD（基因在大肠杆菌中的过量表达为了评估是否可以生产具有功能的 PDC将克隆出SPDC勺ORF开放可读框） 亚克隆到具有组氨酸标记序列的大肠杆菌表达载体pRSETa中。通过SD
16、S-PAGE分析用IPTG诱导的带有pRSETa（表达载体）的大肠杆菌 BL21-CodonPlus- RIPL 的细胞提取物（BL21-Codon Plus 系列：包括 BL21-CodonPlus* （ DE3-RIPL ,BL21-CodonPI 卩 s-RIL , BL21-CodonPI 卩 s （ DE3） -RIL, BL21-CodonPI 卩 s-RP, BL21CodonPlus* （DE3） -RP等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R）,亮氨酸（L）,异亮氨酸（I ）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA基因， 更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene 公司资料），存在于不可溶
