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1、实验六 油菜雄性不育性（株）鉴定选择一、目的学习与初步掌握作物雄性不育系的植物学形态特征与花粉育性 鉴定技术。二、内容说明 作物雄性不育系是指雄性器官发育不正常，无花粉或虽有花粉但 不具有受精能力，而雌性器官发育正常，能接受外来正常花粉受精结 实。当前农作物杂种优势利用方法主要有雄性不育系、雄性不育保持 系与雄性不育恢复系三系配套，以及雄性不育系与雄性不育恢复系两 系配套。特点： 一个优良的雄性不育系必须具有不育性稳定，且不育株率与 不育度都达到 100%，农艺性状好，且整齐一致，柱头外露率高，开 花习性良好，以利提高制种产量。在植株形态、花粉育性等方面与正 常作物有不同。作物雄性不育系的鉴定
2、，一般采用植株形态、花粉育性镜检、套袋自 交鉴定等方法。三、实验仪器设备及材料1. 放大镜、显微镜、镊子、酒精灯、载玻片、盖玻片、回形针或大头针、硫酸纸袋、塑料挂牌、吸水纸、铅笔、1%I-KI溶液等；2. 玉米、油菜等植物的雄性不育株与正常株。四、方法步骤1. 雄性不育系与保持系植株形态特征观察与识别 在不育系繁殖田或杂交制种田对不育系及其保持系（或恢复系）进行逐行逐株观察比较：株型、株高、分蘖、叶色、抽穗开花时间、 花药形态、颜色、开裂等情况与开颖角度等形态区别，断定其是否不育系，并选择你认为区分最明显的3-4 个性状填入表中，以此证实观 察结果。油菜雄性不育系与雄性不育保持系植株形态比较性
3、状不育系保持系花蕾瘦小（短缩呈尖细状），色浅肥大饱满，色深花瓣较小，基部较细（花冠短小、花瓣 短缩，细窄，呈正常的1/2左右， 花瓣基端部突然束细），色浅大，色深花药短小，约为正常的二分之一，顶端 无钩，白色长而肥大，鲜黄 色雌蕊短，呈短颈瓶状，色浅，有的略弯长，呈长颈瓶状（补充内容）玉米雄性不育系与雄性不育保持系植株形态比较性状不育系保持系雄穗不发达发达，松散小穗着生在主轴上着生稀而扁平饱满而个体大颖花开放关闭，不开放开放，花丝伸长花药形态短小，干瘪，浅褐色，不 伸出颖片外，不开裂大而饱满，黄绿色， 开花时伸出颖片，开 裂散粉花粉无花粉或花粉败育，不散粉花粉量很多，散粉2.雄性不育系花粉育性
4、镜检鉴定 （自学）当前生产上利用的雄性不育系多属于核质互作的花粉败育类型。败育花粉经I-KI染色处理，在显微镜下观察，按花粉粒的性状与染色反应分为典型败育、形败育与染色败育型。在镜检过程中，为更准确地鉴定各种类型的花粉，将不育系败育花粉的三种类型与正常花粉的特点列表如下：雄性不育系败育型花粉与正常可育花粉的比较项目典败型圆败型染败型正常可育花粉形状不规则圆形不规则圆形碘反应不染色不染色或少蓝色蓝黑色量浅蓝色套袋自交结实情况不结实不结实不结实结实（1）取样 分别从不育系、保持系（或恢复系）中随机选取即将开 花的穗或花序 2-4 个，挂上标签，带回室内。从中选择花药已伸长达 颖壳（或花蕾）2/3的
5、花朵34 个，剥开内外颖（或花瓣），从每 朵花中取花药 3 个左右作镜检制片。（2）制片 将花药分别置于载玻片上，用镊子轻轻捣碎，滴上一小 滴 I-KI 溶液染色，去掉药壁后，盖好盖玻片，用吸水纸吸去多余的 I-KI，待镜检观察。（3）镜检 将制好的玻片，置于100 倍显微镜下仔细观察。每片 各选择有代表性的视野23 个观察花粉粒的形状与染色反应，正常 花粉因有较多淀粉粒，遇I-KI呈紫黑色，不正常花粉则染色浅或不 染色。数计每个视野内不育花粉粒的数量，并计算不育花粉的百分率。最后根据不育花粉率，判定花粉不育等级。并将取样观察结果列于表中。不育等级正常可育低不育半不育咼不育全不育不育花粉率（%
6、）951003. 雄性不育系套袋自交结实性鉴定套袋自交是鉴定育性最准确、最可靠的方法。即在不育系中选 择刚抽穗或尚未开花的花序3 个，每穗或花序5 朵花，套上羊皮纸 袋，用回形针固定让其自交结实。15 天后取掉纸袋，分别统计其自 交结实情况。凡套袋的株（穗）只有一粒结实的就为结实株（穗）。 再计算不育株（穗）率与不育度。 最后根据不育度，确定不育度等级。将鉴定结果填入表中，并指出其 不育株率与不育度等级。油菜不育系不育度分级标准不育等级正常可育低不育半不育咼不育全不育不育度（）80100复习思考题、作业题：1. 完成表格，并对结果进行分析讨论。2. 还有哪些鉴定花粉活力的方法？其优缺点有哪些？
7、3. 不同农作物雄性不育系最显著的共同特点是什么？补充知识：雄性不育的形态差异雄性不育植株在外部形态上与同品种的正常株极为相似，但是在 开花后，不育株与可育株之间可以从雄花的形态上加以区别： 正常植株的花药都是黄色肥大饱满的，内含很多成熟花粉，花粉粒充 实饱满，形状大小一致，数量多，在适宜条件下能够充分开裂并将花 粉散出。而不育株的花药则色浅瘦小干瘪，内无花粉或无正常花粉，或花粉粒畸形皱缩不规则，无内容物，在适宜条件下，花药不能开裂，也无花 粉散出。除了以上花药与花粉的差异外，还有一些其它的异常形式，如花丝畸 形、花药退化等。有一些不育基因因与其它基因连锁或一因多效，使 一些明显的农艺性状与不
8、育性并存，极有利不育植株的鉴别。如矮杆 籼稻的不育株在抽穗后明显比正常株矮，穗抽不出来，表现有严重的 剑叶包裹穗子的现象。雄性不育的细胞学特征主要反映在花粉败育过程与花药组织结构异 常两个方面。雄性不育的花粉败育特征被子植物不育系花粉败育的形式与时期是多种多样的。单子 叶植物的花粉败育多数达到或接近双核期。双子叶植物花粉败育则多 在四分体形成以前的时期。大量研究证明：雄性不育花粉败育的特点 因不育的遗传基础不同而不同，其遗传基础的差异决定了花粉败育的 形式与时期。小孢子的形成从花粉母细胞开始，到成熟花粉粒为止，整个过程如下：1花粉母细胞-2.第一次减数分裂：前期（细线期偶线期-粗线期f 双线期
9、-终变期）-中期I-后期I-末期I- 细胞质分裂-3.第二次减数分裂：前期-中期-后 期口 -末期-细胞质分裂）-4.四分体-5.单核期：早期 -中期-后期-6.静止期（间期11）-7.第一次有丝分裂：（ 前期f中期-后期-末期）8.双核期-9.第二次有丝分裂：（前期f中期f后期f末期flO.三核期fll.成熟花粉 粒。一般来说，不育系花粉的败育与退化，大都发生在以下四个时期：小 孢子母细胞形成期、 小孢子母细胞减数分裂期、单核花粉期、二核 与三核期。其中前两个时期败育的较少，通常都是在花粉发育时期败 育的，尤其以单核花粉期的败育最为普遍。根据败育时期与形成结构可将花粉败育划分为三种类型。1、
10、无花粉型 从造孢细胞到花粉母细胞减数分裂形成四分体 以前的各个时期，由于细胞进行无丝分裂，原生质块状解体，异形细 胞不断分裂成小细胞后消失，四分孢子体保持收缩状态，细胞解体成 碎片状最后导致花粉囊中无花粉。2、单核败育型 通过减数分裂形成的四分体进一步发育形成花粉 粒，刚形成的花粉粒是一个单核的细胞，在单核花粉晚期败育的称为 单核败育型，它的原生质收缩，核膜消失，核物质与胞质相混逐步解 体消失，内容物空缺，变成空壳花粉或胞壁崩缺退化，花粉囊中最后 只剩下各种畸形的花粉粒。3、双核败育型 花粉发育进入双核以后至花粉发育成正常花粉以 前败育的称为双核败育型，这时生殖核与营养核逐步解体消失，多成 空
11、壳花粉，有些二核期后，生殖核与核仁变小，营养核退化，核膜消 失，花粉充满小液泡，甚至有少量淀粉积累，最后在花粉囊中残存一 些与正常花粉有别的空壳或小粒花粉。花粉败育是一个连续过程，与细胞质与细胞核都有关，有些不育系可 能只表现在同一时期败育的一种花粉败育型，但有些不育系则可能同 时存在不同时期败育的多种花粉败育型。一般规律显示，孢子体不育遗传型的花粉败育相对较早，多为单核败 育型，而配子体不育的花粉败育相对较迟，多为双核型。以电子显微镜研究玉米、小麦、水稻等作物的花粉败育特征，其结果 有一些共同之处，都表现不育花粉比可育花粉的细胞质稀薄，细胞器 较少，质体膨胀；线粒体基质发亮，嵴短而少，逐步退
12、化；内质网不发达，核糖体多为聚核糖体，液泡增多等现象。液泡膜内陷而破坏。水解酶功能活跃。超微结构逐步退化解体，导致花粉的败育。1、绒毡层细胞的异常现象 2、中间层细胞的异常现象 3、花药壁结构的异常及其它三、雄性不育的生理生化特性雄性不育系与可育系在生理生化特性上也存在一些不同。总的来说，不育系的生理代谢水平要比可育系低，在这方面的研究涉及物 质与能量的代谢、蛋白质、酶、激素的变化等方面。一）物质运输与代谢二）能量代谢三）蛋白质1、蛋白质代谢强度的差异2、植物特异蛋白与雄性不育四）氨基酸含量1、总量 2、氨基酸的变异性五）酶的活性1、胼胝酶2、细胞色素氧化酶3、脱氢酶4、葡萄糖6磷酸脱氢酶5、磷酸化酶6、其它酶7、酶的差异六）内源激素核酸缺乏、微量元素的缺乏雄性不育性的花药中，核酸含量的减少，可能归因于酶系统以及核酸 合成所需的核苷酸或先驱物的功能不全；大部分雄性不育花药中显示 出紊乱的氮碳代谢，糖、核酸与氨基酸的含量的变化以及酶的活性 降低，这些变化并不是雄性不育性基因作用的原因，而是其结果。
