从患者开始谈基因检测的整个流程

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1、从患者开始谈基因检测的整个流程题记：几颗玉米放进爆米花机器，出来便是爆米花；一 个智力 一般的高中生放到人大附中，三年后出来就是国际一 流大学新生； 二两五花肉和几个青椒交给一名厨师，出来的 便是香喷喷的回锅 肉。可是这中间都发生了啥是什么重要步 骤将初始原料打磨成了成 品 10ml 的血液或者一块肿瘤组织， 最终变成了一份 20 页的检测 报告这是怎么实现的中间都发 生了什么本文旨在回答这个问题。 基因检测的整个流程可分为哪几个大的步骤概况性地了解 一个事务 的框架是很有必要的，因为这样我们心里会有 “底”。不管别人怎 么分，我简单粗暴地把它分为四个程序： 1，检测前咨询部分； 2，实验室部

2、分； 3，信息分析部分； 4， 临床解读部分。五脏俱 全的基因检测公司应该包含以上所有 的四个程序，除非存在部分业 务外包的情况，例如有的公司 只做临床解读部分。 1）检测前咨询 部分：不是所有的癌症 患者都应该检测，都值得检测，检测目的是 为了明确是否可 以使用靶向药物， 还是仅仅为了玩， 选择哪种产 品更加适合， 这些都是需要在这部分搞清楚。 2）实验部分：应该 取多少 组织样本， 测序过程中有哪些细节步骤， 这可是个核心环 节。 3）信息分析：实验部分做完以后所得到的是一大堆序列， 不 分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是从这些垃圾中挑选 黄金。 4）临床解读：黄金挑选出来不拿去换成大米然

3、后进 肚，那也没什 么用，基因检测的结果有什么意义，对临床实 践又何指导，全在这 里了。四个程序，每个程序又包含哪些 小工序呢通过上面的介绍， 我们可以大体了解基因检测分为 四个程序，也明白四个程序主要做 什么。可是，每一个程序 又具体涉及哪些小程序呢剖析程序的过 程，就是知识差异化 的过程。 1，检测前咨询：患者预期、产品选 择； 2，实验部 分：样本获取与运输、 DNA 制备与文库构建、 质控与上机测 序； 3，信息分析部分：数据分析、报告初稿； 4， 临床解读 部分： 检测报告、 临床实践、 报告解读 /人文关怀。 总而言之， 简单来说，从明确患者的检测目的开始（用药指导，耐 药后 寻找

4、新的方案，仅检测一个基因或多个基因突变状态等） ， 到选择合适的产品，然后获取规范的样本（血液，组织，唾 液 等），然后合适的运输方式到达实验室，然后一些列的规 范实验室 操作及数据分析，最后到科学的检测报告与咨询服 务。这就是四个 程序所包含的内容。每一个程序分为许多小 工序，每一个小工序又 有许多学问与讲究。下面将会详细介 绍每一个小工序。程序一：检 测前咨询部分：患者预期。销 售经理、产品经理、主治医生与患者 需要充分沟通，明确该 基因检测的目的，知道检测技术的局限性， 做好患者的预期 控制。：产品选择。对于基因检测产品来说，产品 选择几乎 等同于检测基因的选择。哪些基因需要强行检测、哪

5、些基 因 推荐检测、 哪些基因有一定的检测价值， 这些需要阐述清楚。 最后，根据患者的经济情况与病情，综合选择（这是理想状 况）。 实际操作过程中， 销售经理往往会以经济利益为导向。 ： 临床信 息。患者的临床信息对于基因检测报告者有重要意 义，信息掌握越 全面报告越个性化，咨询解读也更有针对性。因此，完整详实的 临床申请单需要提供。程序二：实验部分：样本类型。需要明确 一点， 能够运用无创的尽量用无创（唾 液与血液），因为没有一 个患者希望无缘无故的在自己身上打洞。固体：手术样本，穿刺样 本，石蜡包埋组织，石蜡切片组织；液体：全血，血清血细胞， 胸水，腹水，唾液。1）手术样本：（肿瘤组织50

6、mg，癌旁正常 组织25mg,收到组织后立即用至少5倍体积的10%中性福尔马 林固定液固定），切片25张以上，厚度5卩m,肿瘤细胞占比 50%, 坏死组织区域 2）穿刺样本：穿刺一针以上，肿瘤细胞占 比 50%,坏死组织区域 3）石蜡包埋组织：常温保存运输即 可,最好是 1 年以内。 4）石蜡切片组织：常温保存运输即可, 最好是6周以内。5）全血：6ml-10ml for NGS （Streck管，含 有保存液,负压真空抽满 ）,轻轻垂直平面 90旋转10次, 625 C （常温）运输,3 （ 7）日内送达,可用干冰/制热剂制造维 持环境温度。 6）血浆血细胞 （普通试管）：抽血后 2h 内将

7、全 血4C 1600g离心10min，分别收集上清和沉淀至离心管中；上清 再4 C 16000g离心 10min，收集上清血浆转 移至15mL离心管 中。血浆血细胞样品,均封口膜封口,干冰运输。 7）胸水： 8）腹水：这两个情况比较少,至少我们公司很少遇到这样的样 本。 ：质控。血液样本是否合格,是否可以进行测序上机,样本 质量怎么样安捷伦2100生物分析仪或者4200 TapeStation核酸 分析仪，通过DNA完整值（DIN ）来数字化基因组DNA的完整 性。如果不用这些仪器， 可以通过跑胶来实现这一步。质控不合 格，只有重新采样。标准流程只需要卩g DNA , DNA的0D 260/2

8、80在之间，RNA的RIN 值。实验中发现，只要 RIN 值大于 7,就可以获得 比较满意 的结果。 （RIN ：RNA 完整值）。总的来说，质控两 个指标： 1）足够的 DNA 量； 2）完整的 DNA 基因组。这个 步骤在构建 文库后上机测序前完成。 ：文库构建。简而言之， 获取足够量的 / 目的的 /前期适合上机测序而标准处理的 DNA 。其程序主要有：片 段化，连接，扩增。1）片段化：我们总不能直接将那么长的 DNA 去测序吧，测序仪就只能 一次测 几百 bp 的 DNA ，超声波片段化等方法，获得 DNA 片段为正态分 布 200-500bp ，通过一定方法（切割琼脂糖凝 胶电泳条带

9、）选择 所需长度的DNA片段（150-200bp），其它的片段就扔了（不影响 覆盖范围） 。 2）末端修补：上面的方 法（物理方法）片段化的 DNA ，一般来说两端都被破坏了， 不再是平平整整的了，而后续 步骤需要在两端加测序接头， 所以我们得先把这个破坏的两端修补 好。修补所需三种酶： 5端延伸的酶， 5端连接的酶， 3端延伸的酶。 3） 3 端加 A :片段化且两端修补好的DNA，3 端加上一个碱基A,而下步骤的连接接头3端有一个碱基T,这样就实现了碱基互补而连 接起来了。这样做还有以下几个原因:提供 连接效率；防止接头与 DNA 片段多种方向连接；减少接头 之间的连接。值得提的是 1 ）

10、2） 3）的步骤可以用WGSFramentat ion Mix搞定。4）两端加接头：首先明确接头3 端 有一个突出的碱基T,插入片段3端有一个突出的碱基A ;其次， 这个工序是在插入片段两端加入东西；这个东西包括以下几个部分：测序接头（P5, P7;测序时用于与种植在Flow Cell 上的序列碱基互补配对用），Barcode（用于标识该条DNA片 段属于哪个样本，4个碱基），单分子编码序列（Index,用于 识别是哪条DNA片段，12个随机碱基）；其中Y型的序列是已 经商业化的试剂盒。5）PCR富集：如果样本不够，那么我们就 需要扩增它才能上机测序,这就是该环节存在的必要。由于每个经 4）处

11、理的片段两端都有P5与P7,因此PCR引物只需设计与它们 配对的就行了。如果样本足够，这一步就省了呗。6）文库定量： 这里才应该是质控，也就是的步骤。7）基因捕获：我们只将需要 的DNA 片段去测序，不需要的去测不是浪费钱吗于是在测序之前，我们就用这个工序将 目的 DNA 挑选出来（为什么要捕获） ;目前目标序列捕获方法有 3 种， NimbleGesn Sequence Capture array， Agilent SureSelect DNA Capture Array， Agilent SureSelect Target Enrichment System，值得注意的是不同捕获方法可能测

12、序仪器有 不同的要求（捕获的方法有哪些；罗氏和安捷伦）；我们捕获的 探针设计可以自己设计，初步设计，需要检测的位点提交到商业公 司，真正的设计还是需要专业的商业公司来干（捕获探针的由 来）；例如目标区域为100Kb，好的探针 是100%覆盖这100Kb ，而有的商业公司达不到，只能覆盖到 97% ，那么意味着 有 3%的区域捕获不到，更谈不上对这些区域测序了，所以覆盖率 很重要；对于这 100Kb 的目标片 段，前 10Kb 探针捕获了 100 个 片段，第 10Kb-20Kb 的探针 捕获了 10 个片段， 那么这样的话就 是均一性不好， 最终可能 会得出结论 10Kb-20Kb 这一段突变

13、频率 过高 /过低，因此均 一性很重要；如果一个探针设计出来想捕获目 标片段，却捕 获到了别的垃圾片段，我们还对它测序，这不是浪费 钱吗所 以，探针特异性很重要。 (好的捕获是怎么样的) 。 8) PCR 扩增： PCR 再次扩增捕获的 DNA 片段，上机前再一次加足 样本量。 9)文库再次定量：相当于上机前的再一次质量检 测。： 上机测序。通过前面的步骤，我们从患者身上的一块 肿瘤组织或者 一管血开始，然后分离提纯我们需要的基因组 DNA ，再把这些 DNA 打成小片段， 然后再在这些 DNA 小片 段两头接上识别标记 和测序接头，最后再通过基因捕获技术 筛选出目的 DNA ，根据需 求 P

14、CR 扩增。通过这么多步骤，就是为上机测序做准备。一句话，上机测序的过程就是读取 这些DNA 小片段的序列，如 ATCTGGCTT.(160bp) ，这样 万级、 亿级的 DNA 片段个数。 至于这些 DNA 片段是怎么样 在机器上被 测出来的，这又是个大问题，我在液体活检有 哪些这篇文章有 简要说明，这里不管它，毕竟世界上那么 多事情，哪有想管就管得 了的呢至此，实验部分结束。 程序三：信息分析部分 ：下机数据 识别。数以亿计的 DNA 小片段，一大饼，杂乱 无章，很多情况是 几十个患者的样本都一起的，更乱。一句 话，这个步骤将属于不同 患者的 DNA 小片段放进不同的盒 子里，分类。这是怎

15、么实现的呢 我们在构建文库的加接头步 骤时，同时加上了 Barcode 序列，同 个患者使用同一个Barcode,不同的患者使用不同的Barcode,那 么计算机通过这个 Barcode 轻松识别然后放进不同的盒子里。值得注意的 是, DNA 是两条链, 有的公司会两条链同时测序以增加准确 性,因此一 个 A 患者会有两个盒子属于他( A1 ：正义链的 DNA 小片段集合； A2 ：反义链的 DNA 小片段集合) 。还值得注意的是,如果样本是 血液, 有的公司会同时检测 cfDNA 和 gDNA ,那么一个 B 患者就 会有四个盒子属于他 (B1, B2, B3 , B4 )。图像转换。下机的

16、时 候那些 DNA 片段最初其实 是图像格式的，例如红色表示碱基 A,绿色表示碱基T,需 要用专业工具将图像格式转换成序列。 Illumina 公司提供专 业软 件，只需对其调用就可以完成这一步骤。一句话：图像转换成序 列。 ：比对到基因图上。将这些上以亿级的 DNA 小 片段归位， 如果你是 1 号染色体的第 500 位到第 650 位之间 的片段，就把你 归到这个位置下面。当然， 1 号染色体上的这个位置下面一般不止 一条 DNA 片段，毕竟有一个概念叫做测序深度，如果测序深度为 10000，那么理论上该位置下面就应该有 10000 条 DNA 片段。怎 么控制是 10000 条呢这在上机之前构建文库时，通过调节 PCR 扩增来实现。一句话：将散乱的 DNA 小片段比对到参考基因组 上，从而实现它们的定位。这个参考基因组是国际权威数据库给出 的，供给全世界所有人使用。基因组： ；比对软件 BWA ：；： 计算突变频率。假如 1 号染色体的 500 位到第 650 位有 100