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1、用荧光光谱和紫外-可见差谱研究抗体-卟啉的相互作用摘要：meso-四（a, a, a, a-O-苯乙酰苯）卟啉与其单克隆抗体1F2结合后产生显 著的增色效应 反映了卟啉与抗体之间刚性紧密的结合在抗体中的抗原结合部位 存在芳香族氨基酸.用同步荧光光谱结合荧光猝灭法得到抗体抗原结合部位的 芳香族氨基酸主要为色氨酸和酪氨酸但酪氨酸的残基数要少于色氨酸.卟啉与 抗体的结合比为1:1,解离常数（2.084 + 0.246）X10-10 mol/L，可见卟啉与McAb 1F2有很高的亲和力.关键词卟啉：抗体；紫外-可见差谱；荧光光谱1实验部分1. 1仪器和试剂紫外-可见差谱于UV-922型紫外-可见分光光
2、度计（瑞士CONTRON公司） 上测定用1. 0 cm的吸收池。普通荧光光谱和同步荧光光谱用岛津RF-5000荧光 分光光度计测定。所有的溶液都用磷酸缓冲液（PBS, 50 mmo1/L, pH= 7. 2）配制, 所有光谱测定都在20 oC下进行。免疫原meso-四（a, a, a, a-O-苯乙酰苯）卟啉和 单克隆抗体1F2均由本实验室合成和制备。1. 2实验方法1.2.1紫外-可见差谱研究固定MOAb1F2浓度为3. 57 umo1/L, n（抗原）/n（抗体）为02. 5,抗原与抗 体相互作用5 min后测定其紫外-可见差谱。1.2.2荧光猝灭法测定解离常数固定MOAb1F2浓度为0.
3、 03 umo1/L, n（抗原）/n（抗体）为01. 8.激发和发 射狭缝分别固定为5和10 nm.激发波长选在281. 6 nm,发射波长为337.6 nm.抗 原与抗体相互作用20 min后，测定其发射光谱强度的变化。1. 2. 3同步荧光光谱测定卟啉猝灭酪氨酸和色氨酸的荧光固定MOAb1F2浓度为0. 03 umo1/L, n（抗原）/ n（抗体）为01. 3,固定X= 20 nm,测定酪氨酸的荧光变化，固定 X= 80 nm,测定色氨酸的荧光变化, 其余条件同上.1. 2. 4同步荧光光谱测定NBS猝灭抗体1F2的荧光固定MOAb1F2 浓度为 18.6umo1/L, n（NBS）/
4、n（ 1F2）为 134,固定仕 80nm, 其余条件同上。当NBS与压2作用5 min后，测定其荧光发射强度的变化。2结果与讨论2. 1紫外-可见差谱研究在pH=7.2,浓度为50 mmo1/L的磷酸缓冲液中，固定MOAb1F2浓度为3. 57 umo1/L,在抗体的溶液中逐步滴加meso-四（a, a, a, a-O-苯乙酰苯）卟琳，分别测 定它们相互作用后在200600 nm范围内的紫外-可见差谱，结果见图1.由图1可以看出，卟琳与抗体作用后在275nm处出现了一个正的吸收差峰. 随着（卟琳）/n（抗体）增加，其差峰的吸收强度 X275 nm也逐渐增大，说明卟琳 的大兀键与抗体氨基酸残基
5、的大兀键发生相互作用，反映了卟琳与抗体作用后在 它们之间形成了刚性的紧密结合，抗体中的抗原结合部位存在芳香族的氨基酸。Fig. 1 UV-Vis differential speclra of porphyrin after its interaction with McAblF22. 2荧光猝灭法测定解离常数通常在抗体的抗原结合部位都存在Trp残基，当抗原与抗体相结合后，由于 抗原结合部位的Trp会发生化学能转移，从而引起Trp荧光强度的变化.将抗体 在没有结合抗原状态时的荧光强度定义为100%,加入过量抗原，即抗体的所有 抗原结合位点被占据时的荧光强度定义为0,那么可以将加入抗原引起的荧光
6、强 度的变化与抗原结合部位的饱和百分比联系起来，进而可求出抗原抗体的结合 比例以及它们的解离常数.设初始荧光强度为F0 ,加入过量抗原后的荧光强度为Fs,则Fmax= F0-Fs, AFmax为抗体被抗原饱和后引起的最大荧光猝灭，相当于抗体结合位点的 浓度。加入少量抗原后，荧光强度为F,则AF、F0-F，相当于抗体部分结合位点被 抗原结合后引起的荧光猝灭，定义a= AF/AFmax ,表示抗原与抗体结合后的饱 和度。以n（抗原）/n（抗体）对 F作图，结果见图2.从图2可知，当n（抗原） /n（抗体）约为1. 0时，引起的荧光猝灭最大，说明n（抗原）/n（抗体）=1： 1.离解 常数kd的推导
7、公式如下，Ag + Ab AgAb（1）Ku AgAlj/ AgAb（2）AgT/a ot） + AbT（3）式中AbT为加入抗体的总浓度AgT为加入抗原的总浓度.以AgT/ a对1/ （ 1-a）作图（图3）可得一直线。直线的斜率KD（ 2.0840.246）X10-1。mol/L。可见meso-四（a，a，a，a-O-苯乙酰苯）口卜琳与McAb 1F2有很高的亲和力。亲和力强抗体酶的催化活性也较高因此可以很好地解释小分子meso-四（a，a，a，a-O-苯乙酰苯）卜琳能诱导出具有较高催化活性的抗体酶的原因。fig. 2 Plot of wCPurphyrinvt AFFig, 3 Pl4
8、vf /Xl -a) Porphyrin/ff2. 3 口卜琳猝灭酪氨酸和色氨酸的荧光在所有天然氨基酸中仅有色氨酸酪氨酸和苯丙氨酸是荧光基团，但由于三 者在普通荧光光谱上相互重叠，不能同时测定，给蛋白质的研究带来了困难。当 用同步荧光光谱法研究蛋白质时，选择发射波长与激发波长差（AA）为20 nm时， 蛋白质主要表现为酪氨酸的荧光发射峰。在此条件下，酪氨酸的荧光峰基本不受 色氨酸的干扰.当AA= 20 nm时MOAb1F2的最大荧光发射波长位于307. 2nm. 当n（卜琳）/n（ 1F2）达到0. 3时其荧光强度不再下降（图4），说明在抗原结合部位附近有酪氨酸存在。但大部分位于结合位点较远的
9、位置上.用同步荧光光谱法 研究蛋白质 选择；= 80 nm时，主要表现为色氨酸的荧光峰.MOAb1F2的荧光 最大发射峰位于353.6 nm.当n (卟琳)/n ( 1F2)为0. 5时，色氨酸的荧光强度便 不再下降(图5)说明在结合位点附近有色氨酸。与酪氨酸残基相比，有较多的 色氨酸残基处在结合位点及附近位置上。Fig；- 4 Tyr riuorcMCfiice t|iuiiiching liy xiia|)hyaai hFig. 5 Trp fluorcfieence queiilining Iw pnrphyIilhC 30 6 - _II,J5Hl15如既扣拓Fig, 6 Trp i
10、hiorescence quenching by N liS2. 4 NBS对抗体1F2色氨酸荧光的猝灭NBS是一种蛋白质中色氨酸残基的荧光猝灭剂它能使色氨酸的吲哚环氧 化从而使原来的色氨酸残基发生荧光猝灭.当仕80 nm时随着n(NBS) /n( 1F2)比值的增加抗体1F2在353. 6 nm处的荧光强度变化如图6所示。当 n(NBS) /n( 1F2)达到812时，仅能猝灭9.45%的色氨酸荧光；随着比值的进一 步增加也仅能猝灭14. 76%的色氨酸荧光.说明NBS仅能猝灭抗体1F2分子表面 及次表面的色氨酸残基的荧光。即使增大NBS的浓度也不能猝灭抗体内部的色 氨酸残基荧光 说明在1F
11、2分子中大部分的色氨酸残基是位于疏水性较强的内核 环境中。随着卟琳与抗体摩尔比的增加其相互作用后的275 nm紫外差峰强度增 大有较显著的增色效应，反映了在卟琳与抗体之间形成刚性且紧密的结合，抗体 的抗原结合部位有芳香族氨基酸存在。通过荧光猝灭法测定卟琳与抗体的相互作 用 得到卟琳与抗体的结合比为1： 1,解离常数为(2.0840.246)X10-10mol/L。可见卟琳与McAb 1F2有很强的亲和力。用同步荧光光谱法结合荧光猝灭法，选 择入二20nm时，结合位点附近有酪氨酸但大部分酪氨酸处于结合位点较远的 位置上.选择性80nm时，结合位点附近有较多色氨酸存在。但NBS仅能猝灭 抗体1F2分子表面及次表面的色氨酸残基荧光，大部分的色氨酸残基处于疏水 性较强的内核环境中。
