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1、附件6动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺及 沙丁胺醇的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201706）i范围本方法规定了动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的胶体金免疫层析快速检测 方法。本方法适用于猪肉、牛肉等动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速测定。2原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（ T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深 浅的变化。通过检测线与控制线（ C线）颜色深浅比较，对样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁 胺醇进行定性判定。3试剂与材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析
2、纯，水为 GB/T6682规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 甲醇：色谱纯。3.1.2 氢氧化钠。3.1.3 磷酸二氢钾。3.1.4 磷酸氢二钠。3.1.5 盐酸。3.1.6 氯化钠。3.1.7 氯化钾。3.1.8 三氮化钠。3.1.9 乙二胺四乙酸二钠。3.1.10 三羟甲基氨基甲烷，即 Tris。3.1.11 乙酸乙酯。3.1.12 磷酸二氢钠。3.1.13 氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取氢氧化钠（3.1.2） 4g,用水溶解并稀释至 100mL。3.1.14 缓冲液：准确称取磷酸二氢钾（3.1.3） 0.3g,磷酸氢二钠（3.1.4） 1.5g,溶于约800mL水 中，充分混匀后用
3、盐酸（3.1.5）或氢氧化钠溶液（3.1.13）调节pH至7.4,用水稀释至1000mL , 混匀。4 c保存，有效期三个月。3.1.15 展开液：准确称取磷酸二氢钾（3.1.3） 2g,磷酸氢二钠（3.1.4） 1.44g,氯化钠（3.1.6） 8g, 氯化钾（3.1.7） 0.2g,三氮化钠（3.1.8） 0.5g,乙二胺四乙酸二钠（3.1.9） 1.0g溶于约500mL水 中，充分混匀后用水稀释至1000mL。3.1.16 Tris 缓冲全夜（pH9.0, 1mol/L）：称取 Tris （3.1.10） 121.14g,溶于约 700mL 水中,充分混匀 后加入盐酸（3.1.5）调试p
4、H至9.0后用水定容至1000mL o3.1.17 Tris 缓冲全夜（pH9.0, 10mmol/L ）：精密量取 1mol/LTris 缓冲全夜（3.1.16） 1mL,用水稀释定 容至100mL。3.1.18 磷酸二氢钠溶液（0.2mol/L）:称取磷酸二氢钠（3.1.12） 24.0g,用水溶解并稀释至 1000mL。3.1.19 磷酸氢二钠溶液 （0.2mol/L）:称取磷酸氢二钠 （3.1.4） 28.4g ,用水溶解并稀释至 1000mL。3.1.20 磷酸盐缓冲液（pH7.4, 0.2mol/L）:量取磷酸二氢钠溶液（3.1.18） 19mL ,加入81mL磷酸 氢二钠溶液（3
5、.1.19）,混匀。3.1.21 磷酸盐缓冲液（pH7.4, 10mmol/L）：精密量取 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（3.1.20） 50mL,用 水稀释至1000mL。3.2 参考物质克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1,纯度97%。表1克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量序号中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子质量1克伦特罗Clenbuterol37148-27-9C12H18Cl2N2O277.192莱克多巴胺Ractopamine97825-25-7Ci8H
6、23NO3301.383沙丁胺醇Salbutamol18559-94-9C13H21NO3239.31注：或等同可溯源物质。3.3 标准溶液配制3.3.1 标准储备液：精密称取适量克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇参考物质（3.2）,分别置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为100pg/mL的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准储备液。-18 C保存，有效期一年。3.3.2 克伦特罗标准中间液（1科g/mL：精密量取克伦特罗标准储备液（100科g/mL （3.3.1） 1mL置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 g/m
7、L的克伦特罗标准中间液。临用新制。3.3.3 克伦特罗标准工作液（20ng/mL）：精密量取克伦特罗标准中间液（1科g/mL （3.3.2） 1mL,置于50mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 20ng/mL的克伦特罗标准 工作液。临用新制。3.3.4 莱克多巴胺标准中间液（1科g/mL :精密量取莱克多巴胺标准储备液（100 g g/mL （3.3.1）1mL置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1科g/m而莱克多巴 胺标准中间液。临用新制。3.3.5 莱克多巴胺标准工作液 （20ng/mL ）:精密量取莱克多巴胺标准中间液 置
8、于50mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 准工作液。临用新制。3.3.6 沙丁胺醇胺标准中间液（1科g/mL：精密量取沙丁胺醇标准储备液（ 置于100mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 中间液。临用新制。3.3.7 沙丁胺醇标准工作液（20ng/mL）：精密量取沙丁胺醇标准中间液（ 置于50mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 工作液。临用新制。(1 g g/mL (3.3.4) 1mL, 20ng/mL的莱克多巴胺标100 科 g/mL (3.3.1) 1mL1科g/mL的沙丁胺醇标准1 g g/mL (3.3
9、.6) 1mL, 20ng/mL的沙丁胺醇标准3.4 材料3.4.1 克伦特罗试剂盒/检测卡（条）：含胶体金试纸条及配套的试剂。3.4.2 莱克多巴胺试剂盒/检测卡（条）：含胶体金试纸条及配套的试剂。3.4.3 沙丁胺醇试剂盒/检测卡（条）：含胶体金试纸条及配套的试剂。3.4.4 固相萃取柱：丙烯酸系弱酸性阳离子交换柱。4仪器和设备4.1 电子天平：感量为 0.01g和0.0001g。4.2 组织粉碎机。4.3 水浴箱。4.4 离心机：转速 4000r/min）4.5 移液器：10 壮，100 山，1mL, 5mL。4.6 读数仪：产品配套可使用的检测仪器（可选）4.7 固相萃取装置（可选）。
10、4.8 其他产品说明书操作中需用的仪器。4.9 环境条件：温度 10-40C,湿度80%。5分析步骤5.1 试样制备取适量具有代表性样品的可食部分，充分粉碎混匀。5.2 试样提取和净化称取适量试样，按照方法一（5.2.1）或方法二（5.2.2）提取步骤分别对空白试样、加标质控 样品、待测样进行处理。5.2.1 方法一（隔水煮法）称取粉碎混匀的样品5g （精确至0.01g）于50mL离心管，置90c水浴中加热20min至离心管中可清晰看见有组织液渗透，4000r/min离心10min ,将上清液转至另一离心管，重复离心操作一次。准确量取上清液900 L,加入缓冲液（3.1.14） 100 dL混
11、匀，即得待测液。本方法推荐水浴加热，也可按照试剂盒说明书进行操作。5.2.2 方法二（固相萃取法）称取粉碎混匀的样品5g （精确至0.01g）于50mL离心管，加入10mmol/LTris缓冲液（3.1.17）5mL ,剧烈振摇5min,放置20min ,加入乙酸乙酯（3.1.11） 10mL ,剧烈振摇1min。以4000r/min 离心2min,上清液待净化。连接好固相萃取装置（4.7）,并在固相萃取柱（3.4.4）上方连接30mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中液体全部流过固相萃取柱，尽可能将固相萃取柱中溶液去除干
12、净。将固相萃 取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，向固相萃取柱中加入0.5mL10mmol/L磷酸盐缓冲液（3.1.（21） 手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中，即得待测液。注：试样制备过程可按照试剂盒说明书进行操作，不做限定。5.3测定步骤5.3.1 检测卡与金标微孔测定步骤测试前，将未开封的检测卡恢复至室温。吸取100dL上述待测液于金标微孔中，上下抽吸 5-10次直至微孔试剂混合土匀。室温温育5min,将反应液全部加入到检测卡的加样孔中，1min后加入1滴展开液（3.1.15）。检测卡加入样本后10min进行结果判定。5.3.2 无金标微孔
13、时，检测卡测定步骤测试前，将未开封的检测卡恢复至室温。吸取100dL上述待测液直接加入到检测卡加样孔中，1min后加入1滴展开液（3.1.15）。检测卡加入样本后10min后进行结果判定。5.3.3 试纸条与金标微孔测定步骤测试前，将未开封的试纸条恢复至室温。吸取100dL上述待测液于金标微孔中，上下抽吸 5-10次直至微孔试剂混合土匀。室温温育1min,将试纸条样品垫插入到金标微孔中。室温温育4min,从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端样品垫，进行结果判定。注：1.测定步骤建议按照试剂盒说明书进行操作。2.结果判定建议使用读数仪，读数仪的具体使用参照仪器使用说明书。5.4质控试验每批样品应同
14、时进行空白试验和加标质控试验。5.4.1 空白试验称取空白试样，按照 5.2和5.3步骤与样品同法操作。5.4.2 加标质控试验称取空白试样5g（精确至0.01g）置于50mL离心管中，加入适量克伦特罗标准工作液（20ng/ml）（3.3.（3） 克伦特罗浓度为 0.5 g/kg按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。称取空白试样 5g （精确至0.01g）置于50mL离心管中，加入适量莱克多巴胺标准工作液（20ng/ml） （3.3.3）,使莱克多巴胺浓度为0.5科g/kg按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。准确称取空白试样 5g （精确至0.01g）置于50mL离心管中，加入适量沙丁胺醇标
15、准工作液（20ng/ml） （3.3.3）,使沙丁胺醇浓度为 0.5科g/kg按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。6结果判定要求3.1 读数仪测定结果通过仪器对结果进行判读。3.1.1 无效当质控线（C线）不显色时，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。3.1.2 阳性结果若检测结果显示 “+”（阳性），表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检测限。3.1.3 阴性结果若检测结果显示:（阴性），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检测限。3.2 目视判定通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。3.2.1 无效当质控线（C线）不显色时，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。3.2.2 阳性结果质控线（C线）显色，若检测线（T线）不出现或出现但颜色浅于质控线（ C线），表示试样 中含有待测组分且其含量高于方法检测限，判为阳性。3.2.3 阴性结果质控线（C线）显色，若检测线（T线）颜色深于或等于质控线（C线），表示试样中不含待
