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1、致病菌细胞的近红外光谱鉴别方法研究食品与生物工程学院 荣宗有指导教师 刘建学摘要致病菌,即能够导致人类疾病或危害人类健康的细菌。致病菌污染食品可导致食物中毒与食源性感染，是食品安全的重大隐患。近红外光谱技术(NIRS)是一种高效快速的现代分析技术,是近年来发展最快的检测技术之一，具有无损、快速、高效、方便和环保的特点。本文以沙门氏菌和单增李斯特菌为代表，采用平板划线法对沙门氏菌和单增李斯特菌的分离培养进行研究。结果表明，用亚硫酸铋琼脂（BS）培养基、改良的MC Bride琼脂（MMA）培养基可将沙门氏菌、单增李斯特菌从杂菌中很好的分离开来；用光电比浊法，对沙门氏菌的对数生长期进行研究。通过比较
2、沙门氏菌的生长曲线图，研究其生长趋势，确定了沙门氏菌的对数生长期，最后选定16h为沙门氏菌的培养时间；以对数生长期的沙门氏菌、单增李斯特菌等致病菌为研究对象，考察近红外光对致病菌细胞的作用，根据不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱图谱，利用基于主成分分析技术（PCA）的投影判别分析，研究两种菌的近红外光谱鉴别方法。结果表明，不论是利用全细胞、细胞壁还是细胞质的近红外光谱分析，都可以将大肠杆菌和单增李斯特菌区分开来。关 键 词：近红外光谱，沙门氏菌，单增李斯特菌，主成分投影分析，鉴别方法 RESEARCH ON THE NEAR-INFRARED SPECTR
3、OSCOPY DISTINCTION METHOD OF PATHOGENIC BACTERIA CELLSFood and Bioengineering College Rong ZongyouTutor Liu JianxueABSTRACTThe pathogenic bacteria，which can cause the human illness to get sick or harm to human health of bacteria. Pathogenic bacteria contaminated food can cause food poisoning and foo
4、d-borne infection，which is the significant hidden danger of food security. The near-infrared spectroscopy (NIRS)is one of the fastest growing testing technology，which take on the characteristic of nondestructive, fast, efficient, convenient and environmentally friendly.In this paper, we take the Sal
5、monella and Listeria monocytogenes as the representative, using the methods of Plate crossed separation research the isolation and culture of Salmonella and L.monocytogenes. The results showed that，Salmonella and L.monocytogenes can be easily identified from Mixed bacteria With bismuth sulfite agar
6、(BS) medium, modified MC Bride agar (MMA) medium. Taking the use of photoelectric turbidimetry, the logarithmic growth phase of Salmonella was researched. In this study, the growth curves of Salmonella were compared to their growth chart, from which we can see the growth trend of Salmonella. The log
7、arithmic growth phase of Salmonella can be determinated. At last, 16h was selected to the Salmonella culture time. We take the logarithmic growth of Salmonella, Listeria monocytogenes pathogenic microorganisms for object of study, Inspects the near-infrared light function to the pathogenesis bacteri
8、al cell. A study about the near-infrared on the distinction method and the examination limit of both pathogenic bacteria cells had been carried out, using the projection discriminant analysis which is based on the principal component analysis (PCA). According to the different concentration gradient
9、of near infrared spectra of the Salmonella and L.monocytogenes Whole-cell、cell wall and cytoplasmic, the Salmonella and L.monocytogenes can be distinguished.KEY WORDS：Near-Infrared spectroscopy，Salmonella， L.monocytogenes，PCA，Identification method / 文档可自由编辑打印目 录前 言1第1章 文献综述21.1 沙门氏菌的概论21.1.1 沙门氏菌的病原
10、学特性21.1.2 沙门氏菌的发病机理21.1.3 沙门氏菌的临床症状31.2 单增李斯特菌的简介31.3 有害致病菌检测技术的概述31.3.1 色谱技术41.3.2 化学比色法41.3.3 近红外光谱检测技术41.4 近红外光谱概论51.4.1 近红外光谱分析技术的原理51.4.2 近红外光谱分析技术的特点61.4.3 近红外光谱分析技术的应用7第2章 材料与方法82.1 试验材料82.1.1 菌种82.1.2 试剂82.1.3 培养基82.1.4 试验仪器92.2 试验方法102.2.1 沙门氏菌的分离培养102.2.2 单增李斯特菌的分离培养112.2.3 沙门氏菌的生长曲线测定112.
11、2.4 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的制备122.2.5 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的制备132.2.6 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱采集132.2.7 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱采集14第3章 结果与分析153.1 沙门氏菌的分离培养结果153.2 单增李斯特菌的分离培养结果153.3 沙门氏菌的生长曲线153.3.1 比浊法测定的吸光度153.3.2 生长曲线的绘制163.4 沙门氏菌、单增李斯特菌的鉴别方法研究173.4.1 沙门氏菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱图173.4.2 单增李斯特菌全细胞、细胞壁、细胞质的光谱图183.4.3 沙门氏菌、单增李斯特
12、菌全细胞的鉴别分析193.4.4 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞壁的鉴别分析203.4.5 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质的鉴别分析21第4章 结 论234.1 总结234.2 展望23参考文献25致谢27前 言沙门氏菌(Salmonella)是一种人畜共患和食源性疾病的致病菌。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。虽然这些方法
13、本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要47天才能完成。单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)也是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。单增李斯特菌在各年龄段人群中均可发病，尤其免疫机能低下者和新生儿、孕妇、老年人等，病死率高达20%30%。应用常规方法检验耗时费力，程序复杂。采用聚合酶链反应(PCR)法检测，也需要24小时才能完成检测过程，仍然满足不了实时检测的需要。进入90年代，近红外分析技术逐步受到分析化学家的重视，应用逐步扩展到石油化工、医药、生物化学、烟草、纺织品等领域,现已发展成为一种独立的分析技术活跃在光谱分析领域。傅立叶变换近红外
14、光谱(FTNIR)分辨率高，不仅能提供分子基团特征的振动吸收谱带，而且能敏锐地探测分子基团及周围环境的变化。细胞的近红外光谱能够反映核酸、蛋白质、糖蛋白和生物膜等分子在细胞内的含量、构型、构象及其所发生的变化。通过建立其近红外光吸收模型，找到食品中对数期的沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外特征吸收光谱，使得不同致病菌能够区分开来。因此，通过不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌细胞的红外光谱来获得沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外光谱信息，继而研究沙门氏菌、单增李斯特菌的近红外光谱的鉴别方法，将有可能对有害微生物的鉴别测定提供一种快速简便的检测方法，具有较好的应用前景。此外，近红外光谱分析技术在微生物学
15、方面的应用，又可能为人类疾病的早期诊断提供科学依据。研究近红外光谱分析技术来检测食品中常见的致病菌，具有极大的经济和和社会效益。第1章 文献综述1.1 沙门氏菌的概论沙门氏菌属（Sallmonall）是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属，它包括2000多个血清型。病原学认为，沙门氏菌是一种人畜共患和食源性疾病的致病菌1。世界各地的食物中毒中，英国、中国沙门氏菌食物中毒居首位，美国居第二位。食源性致病菌作为一个严重的公共卫生问题是影响食品安全的主要原因之一，它严重危害着人们的生命健康从而造成重大经济损失2。因此，对致病性细菌的快速检测一直是相关研究的热点。1.1.1 沙门氏菌的病原学特性1、形态与染色沙门氏菌为革兰氏阴性，较为细长的杆菌，大小为（13m）（0.40.9m），不产生芽孢，一般无荚膜，但在黏液样变异时，可见菌体黏液层增厚。2、培养特性沙门氏菌为需氧或兼性厌氧菌。生长温度为1042，最适温度为37。适宜pH为6.87.8。对营养要求不高，一般在普通培养基上均能良好生长。在培养集中若加入硫代硫酸钠、胱氨酸、血清、葡萄糖、淀粉、脑心浸液、胶体硫或甘油等，均有助于本菌的生长。普通琼脂培养基：培养24小时后，形成中等大小、圆形或近似圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落。普通肉汤培养基：生长良好，均等
