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1、土壤微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较生命科学学院 级专业：生物工程姓名:指导教师 无摘要：本实验是微生物学综合性实验项目，包含了微生物学实验中的微生物的分离和纯化、微生物的选择性培养、平板菌落计数（即活菌计数）、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物主要类群的培养特征和形态特征、制片染色技术等。1本文记录了对采自校园附近农田的土样中微生物主要类群的分离和纯化等试验操作方法和结果。所采每克土样中几种不同类群微生物的含量分别为：细菌 6.63*107个、放线菌7.38*105个、霉菌2.33*104个，说明土壤中 微生物种类的繁多和数量的庞大。培养基的种类和组分的不同可用于分离或富集不同的微生
2、物。关键词：分离纯化平板菌落计数微生物的形态1 .前言：（1）、微生物在自然界及其在土壤中的分布简况；微生物因其体积小、重量轻和数量多等原因，可以到处传播以致达到“无孔不入”的地步，只 要条件合适，它们就可“随遇而安”。地球上除了火山的中心区域等少数地方外，从土壤圈、水圈、 大气圈至岩石圈，到处都有它们的踪迹。由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条 件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”，对人类来说，则是最丰富的菌种资源库。尽管土壤的类型众多，其中各种微生物的含量变化很大，但一般来说，在每克耕作层
3、土壤中，各种微生物含量之比大体有一个10倍系列的递减规律：细菌（108） 放线菌（107,抱子）霉菌（106,抱子）酵母菌（105） 藻类（104） 原生动物（103）（2）、土壤中各种类群的微生物的含量的大致情况；土壤微生物包括细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物5大类群。是土壤生物中数量最多的一类。细菌每克表层土壤中约含细菌几百万至几千万个，是土壤菌类中数量最多的一个类群；放线菌,每克表层土壤约含放线菌几十万至几千万个，是数量上仅次于细菌的一个类群；真菌，每克表层土壤只含真菌几千至几十万个，是土壤菌类中数量最少的一个类群，但其生物量指每平方米面积中菌 体的重量（克）高于细菌和放线菌；藻类，直
4、径350微米,喜湿，多栖居于土壤表面或表土层中，数 量较菌类少。土壤中常见的有绿藻、蓝藻和硅藻。蓝藻中有的种类能固定空气中的氮素。（3）、土壤中的微生物的作用；土壤微生物在土壤中的作用是多方面的，土壤微生物的区系组成、生物量及其生命活动对土壤的形成和发育有密切关系。同时，土壤作为微生物的生态环境，也影响微生物在土壤中的消长和活性。并参与土壤有机物质的矿化和腐殖质化过程；同时通过同化作用合成多糖类和其他复杂有机物质，影响土壤的结构和耕性。土壤微生物的代谢产物还能促进土壤中难溶 性物质的溶解。微生物参与土壤中各种物质的氧化-还原反应，对营养元素的有效化也有一 定作用。参与土壤中营养元素的循环，包括
5、碳素循环、氮素循环和矿物元素循环，促进植物 营养元素的有效性。某些微生物有固氮作用，可借助其体内的固氮酶将空气中的游离氮分子 转化为固定态氮化物。与植物根部营养关系密切。植物根际微生物以及与植物共生的微生物 如根瘤菌、菌根和真菌等能为植物直接提供氮素、磷素和其他矿质元素的营养以及各种有机营养，如有机酸、氨基酸、维生素、生长刺激素等。能为工农业生产和医药卫生事业提供有 效菌种，培育高效菌系，如已在农业上应用的有根瘤菌剂、固氮菌剂和抗生菌剂等。某些抗 生性微生物能防治土传病原菌对作物的危害。降解土壤中残留的有机农药、城市污物和工厂 废弃物等，降低残毒为害。某些微生物可用于沼气发酵，提供生物能源、发
6、酵液和残渣有机 肥料。（4）、本实验的主要过程和实验结果，对实验结果的简单说明和分析，通过实验得到的结论等。本实验通过采样、选择性培养、平板菌落计数（即活菌计数卜培养基的制备、高压蒸汽灭菌、等方法，对土壤中的微生物进行分离计数，并通过革兰氏染色等实验观察方法对微生物个体形态等进 行培养与观察，以及制片染色技术等。结果发现土壤中微生物的含量极为丰富，含有霉菌，细菌， 放线菌菌种。通过比较对微生物形态等有所进一步的了解与认识。2 .材料与方法2.1 材料2.1.1 土样：以无菌方式采于学校内小园林，置于无菌容器中，待检o d o 4笑苜2.1.2 1口乔92.1.2.1 营养琼脂（牛肉膏蛋白月东固
7、体培养基）1:牛肉膏3g/L蛋白脐10g/LNaCI5g/L琼脂 15-20g/L水 500mlpH 7.0-7.2121c灭菌 20min2.1.2.2 高氏一号固体培养基 11：可溶性淀粉20g/L硝酸钾1g/L氯化钠0.5g/L磷酸氢二钾 0.5g/L硫酸镁0.5g/L硫酸亚铁 0.01g/L琼脂20g/L水 500mlpH 7.2-7.4 配置时，先用少量冷水，把淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至500ml , 121C灭菌20min,灭菌后，在100ml培养基中加入10%酚溶液5滴（作为抑制剂，以抑制细菌的生长），制备平板备用。2.1.
8、2.3 查氏固体培养基1：硝酸钠2g/L磷酸氢二钾1g/L硫酸镁（MgSO4 7H2O）0.5g氯化钾 0.5g/L硫酸亚铁 0.01g/L蔗糖 30g/L 琼脂 15-20g/L水 500mLpH自然分装后121c灭菌20min2.1.2.4 马丁氏培养基：1： KH2PO4 1g/LMgSO4 7H2O 0. 5g/L蛋白陈5g/L葡萄糖10g/L琼脂 15 20g/L蒸储水500mlpH自然1/3000孟加拉红水溶液33mg/L121c灭菌30min临用前加入 0.03%链霉素稀释液100ml,使每毫升培养基中含链霉素30ug2.1.2.5 无菌水：装有90ml蒸储水和数拾粒玻璃珠的25
9、0ml锥形瓶一只，装有9ml蒸储水的18M80mm试管数支；121.3 C, 20分钟灭菌，备用2.1.3 染色液2.1.3.1 革兰氏染色液1草酸俊结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液等2.1.3.2 0.1%美蓝1用于放线菌菌丝形态观察2.1.3.3 乳酸石炭酸棉蓝液1 A液：碱性复红（basic fuchsin） 0. 3g95% 酒精 10mlB液：石炭酸5 . 0g蒸储水95ml将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酉精，继续研磨使其溶解，配成 A液。将石炭酸溶解于水中，配成B液。混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释510倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。用于霉
10、菌形态观察2.2 方法2.2.1 制备土壤稀释液称取土样10g ,放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使土样与水充分混合，将细胞分散。 静置，成为土壤悬液（10-1）。用1mL的无菌吸头从中吸取1mL 土壤悬液注入盛有 9mL无菌水的试管中，吹吸 3次，振荡混匀（10-2）。然后再用同一支1mL吸头， 从此管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中（10-3）,依此类推制成10-4, 10-5,10-6, 10-6各种稀释度的土壤溶液。2.2.2 制备及涂布平板用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-7、10-6和10-5的土壤稀释液中各吸取 0.2mL菌液于已备好的2.1.
11、2.1平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度 分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-6、10-5和10-4的土壤稀释液中各吸取 0.2mL菌液于已备好的2.1.2.2平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度， 继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-5、10-4和10-3的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.3平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面
12、轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度 分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-5、10-4和10-3的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.1平板，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度 分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做1个平板。2.2.3 培养 培养基2.1.2.1平板倒置于37c培养箱，23天； 培养基2.1.2.2平板倒置于28c培养箱57天；培养基2.1.2.3和培养基2.1.2.4平板倒置于28c培养箱35天
13、；2.2.4 菌落计数 培养结束后，根据不同类群的微生物的菌落特征， 分别在不同的培养基平板上统计 相关类群的微生物菌落，即培养基 2.1.2.1统计细菌的菌落；培养基 2.1.2.2统计放线菌的菌落；培 养基 2.1.2.3 和培养基 2.1.2.4统计霉菌的菌落。由下式计算每克土壤中相关微生物的菌落形成单位（cfu）：个/克=同一稀释度三次重复的平均菌落数淅释倍数X52.2.5 挑单菌落从不同的培养基平板上，选取细菌、放线菌和霉菌各三个菌落分别转接到营养琼脂、高氏一号、查氏培养基斜面中，每个菌落接两支斜面试管，编号标记，分别 置培养箱培养，备用2.2.6 细菌的革兰氏染色和形态观察对从2.
14、2.5中选出的细菌分别做革兰氏染色，观察记录三株细菌的革兰氏染色结果和个体形态2.2.7 放线菌的插片培养和形态观察对从2.2.5中选出的放线菌分别做平板划线、插片培养，培养后观察记录三种放线菌的菌丝形态。每个平板中，以约 45。角将1-2片无菌盖玻片斜插入平板上第一 次划线的部位。2.2.8 霉菌的点植培养和形态观察对从2.2.5中选出的霉菌分别做点植培养，每个平板上点植接种三个点，培养后制片，观 察、记录三种霉菌的菌丝和产无性抱子的子实体的形态3 .结果3.1 土壤样品中细菌、放线菌、霉菌的菌落形成单位（ cfu）见表1、表2、表3:表1稀释度10-5细菌10-610-7，一一1874721各重复的 2763350菌落数3986731cfu/克4.35*10 62.45*10 71.70*10 8平均（cfu/克）6.63*10 71表2稀释度10-4放线菌10-510-6，一 一,142162各重复白11259162菌落数348262cfu/克52.48*1059.67*101.00*10 6平均（cfu/克）7.38*10 5表3稀释度10-3霉菌-41010-5/口加小各重复的 菌落数cfu/1232.1.2.300002.1.2.48016513546.33*102.1.2.32331.33*1042.1.2.4182201052.1.
