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1、项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究首席科学家：张丽华 中国科学院大连化学物理研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容拟解决的关键科学问题随着对复杂生物体系蛋白质组质谱数据挖掘和蛋白质功能分析的深入进行，迫切需要获得大量蛋白质的定量信息。发展具有自主知识产权的高精度、高准确度、高覆盖率和高通量的规模化蛋白质定量新材料、新技术、新方法和新系统，对于推动蛋白质科学的深入研究具有重要意义。因此，本项目针对目前规模化蛋白质定量现有方法和技术存在的缺陷，拟重点解决以下关键科学和技术问题： （1）蛋白质或肽段回收率、分辨率和鉴定覆盖率低的问题； （2）蛋
2、白质组相对和绝对定量分析的精确度和准确度差的问题； （3）规模化蛋白质定量分析的通量和自动化程度低的问题。 研究内容针对科学问题（1），开展高效低残留的样品处理和分离新材料的研究（研究内容1）；针对科学问题（2），开展基于色谱-质谱的蛋白质组相对和绝对定量新方法和新技术的研究（研究内容2和3）；针对科学问题（3），开展集成化蛋白质组定量分析系统的研究（研究内容4）。此外，利用发展的新材料、新技术、新方法和新系统，示范性开展重要模式生物（如酵母）和肿瘤（如肝癌）相关蛋白质组的定量研究（研究内容5）。1. 高效低残留的蛋白质组样品处理和分离新材料 1）样品处理新材料：通过化学和物理方法，对磁性材料
3、、整体材料、介孔材料和多孔材料等样品处理材料进行表面修饰，有效降低基质的非特异性吸附，提高蛋白质和多肽的回收率； 2）蛋白质丰度均衡新技术：基于噬菌体展示文库、适配体文库等配基，发展蛋白质组均衡技术，通过在去除多种高丰度蛋白质的同时富集低丰度蛋白质，提高蛋白质组鉴定的覆盖率； 3）蛋白质高效分离新材料：研制新型大孔微球、超细粒径颗粒和杂化整体材料，实现蛋白质的低残留、高分辨分离。 2. 基于色谱-质谱的蛋白质组相对定量新方法和新技术1）标记相对定量方法：建立基于体内终端氨基酸同位素标记、串联18O同位素标记、金属离子或其他化学试剂等非同位素标记的大规模蛋白质相对定量新方法，提高标记相对定量的精
4、确度、准确度和覆盖率； 2）非标记相对定量方法：发展基于流动相添加内标、曲线拟合等色谱-质谱联合定量新方法、基于化学修饰的肽段高效率、高稳定性离子化新技术，以及基于蛋白质特征肽段的多反应监测质谱高通量相对定量方法，提高非标记相对定量的精确度和准确度； 3）定量数据解析算法：建立基于高阶线性分解模型、统计模型、分析模型等多种蛋白质组数据处理方法，提高对不同丰度蛋白质的定量分析能力；研究肽段一级谱特征的识别与提取、二级谱图母离子质量的校准、“混合”二级谱的识别与鉴定和肽段保留时间测算，提高质谱定量信息的可利用率；研究基于一级/二级谱图的标记/非标记定量算法和肽段/蛋白定量比值准确性评价算法，提高蛋
5、白质定量计算的准确度。 3. 基于色谱-质谱的蛋白质组绝对定量新方法和新技术 1）内标肽的设计、合成和表征：设计合成内标肽，并采用标准氨基酸、稳定同位素标记的氨基酸同位素稀释法，结合选择性反应检测质谱，建立内标肽的准确表征新方法，为蛋白质组的准确定量提供参考物质； 2）标记蛋白质组绝对定量新方法：发展蛋白质的生物双重标记、固相标记和金属元素标记等蛋白质多重标记技术，以及色谱保留时间与多反应监测质谱结合的目标蛋白质组绝对定量方法，提高蛋白质组绝对定量的通量，实现蛋白质组的动态监测； 3）非标记规模化蛋白质组绝对定量新方法：发展质谱图计数与多反应监测质谱结合的定量方法，以及绝对定量数据提取和处理方
6、法，提高复杂生物样本中蛋白质组绝对定量的准确度。 4. 集成化蛋白质组定量分析系统 1）在线样品处理系统：设计蛋白质在线变性、还原和烷基化装臵，研制缓冲溶液交换接口，制备高效低残留固定化酶反应器，并通过上述部件的集成，构建在线蛋白质组样品处理系统，实现蛋白质组的高效、高通量和低损失率的在线处理； 2）在线标记系统：研制基于新型样品处理材料的蛋白质组通用或选择捕集柱，并通过优化同位素或非同位素原位固相标记条件，构建在线标记系统，实现蛋白质或肽段的高通量标记； 3）集成化蛋白质组定量系统：构建样品处理、标记、分离、鉴定和数据处理的规模化蛋白质定量集成化系统。 5. 复杂样本的定量蛋白质组分析 1)
7、 采用国际通用的模式生物（如酵母），对发展的新材料、新技术和新方法进行评价，并建立标准化操作流程； 2) 针对肿瘤（如肝癌等）发生发展相关的潜在分子标记物群和治疗靶点群，示范性地开展相关蛋白质的规模化定量分析。二、预期目标1 总体目标 发展具有原始创新性的蛋白质定量新方法和相关技术，使我国在高效低残留的蛋白质样品处理和分离材料、基于色谱-质谱的蛋白质组绝对和相对定量技术，以及高通量、自动化的蛋白质组定量分析系统方面达到国际领先水平，并力争引领国际发展趋势。所发展的新材料、新方法、新技术和新系统能够为我国科学家实现重要生物体系蛋白质组的高精确度、高准确度、高通量和深度覆盖的定量分析，以及与疾病相
8、关的潜在生物标志物筛选以及药物靶标蛋白质的寻找等蛋白质科学前沿领域研究提供重要技术支撑。 2. 五年目标通过本项目的实施，发展一批具有自主知识产权或原始创新的规模化蛋白质定量新材料、新技术、新方法和新系统，显著改善规模化蛋白质定量的回收率、精确度、准确度、覆盖率和通量。具体目标包括： 1) 研制高效低残留蛋白质样品处理和分离材料，将蛋白质或肽段的回收率提高到90%以上，峰容量达到100以上； 2) 提供高精确度蛋白质组相对定量新方法，变异系数小于20%；提供高准确度蛋白质组绝对定量新方法，误差小于10%，经质谱鉴定的目标蛋白质的绝对定量覆盖率达到80%以上； 3) 构建自动化蛋白质定量分析系统
9、，实现样品在线处理、分离和鉴定，单次运行可以定量1000种以上蛋白质，变异系数小于15%； 4) 编制蛋白质定量软件，使谱图鉴定率提高到50，定量准确性比Census软件提高20%； 5) 发表SCI论文80篇以上，其中IF8文章10篇，IF5文章30篇；申请发明专利20项； 6) 培养杰青1-2人，博士30人，博士后10人；形成一支优秀的定量蛋白质组新方法和相关技术的人才队伍。 三、研究方案1. 总体学术思路、技术路线和可行性分析总体学术思路：本项目的总体学术思路如图1所示。将针对蛋白质组研究前沿领域迫切需要解决的规模化蛋白质定量精确度和准确度差、分析通量和覆盖率低等关键科学问题，拟从样品处
10、理和分离材料、高精度和高准确度的相对定量、绝对定量方法和技术，以及集成化定量分析系统四个层面出发，侧重发展可满足蛋白质组定量分析需求的新材料、新技术、新方法和新系统，为推动我国蛋白质科学的发展提供重要技术支撑。图1 项目总体学术思路技术途径： 本项目将通过蛋白质组样品处理和分离新材料、基于色谱-质谱的定量新技术、以及集成化定量分析平台等3个层面的多种途径实现总体学术思路。 1）高效低残留的样品处理和分离新材料：采用点击化学、可逆加成断裂链转移聚合和原子转移自由基聚合反应等方法，对样品预处理材料进行表面修饰；采用自组装、热聚合、光聚合、溶胶凝胶法、凝胶法、融盐法、分散聚合、沉淀聚合和蒸馏沉淀聚合
11、反应等方法，制备蛋白质分离材料；利用噬菌体展示抗体可变区片段文库和适配体库为配基，研制蛋白质均衡器。2）基于色谱-质谱的高精确度和高准确度的蛋白质定量新方法和新技术：采用体内终端氨基酸同位素标记、双功能试剂/稀土金属络合物化学标记、流动相添加内标法、曲线拟合法、化学衍生技术、可信肽段预测方法、高阶数据处理等技术，发展高精确度的蛋白质组相对定量新方法；采用化学合成内标肽技术、生物表达内标肽技术、稳定同位素标记的氨基酸同位素稀释法和质谱多反应监测等技术，发展高准确度的蛋白质组绝对定量新方法。 3）高通量、自动化定量分析新系统：采用热变性、化学变性、微透析技术、固定化酶反应器、固相标记技术、缓冲液臵
12、换技术、多维色谱分离、生物质谱鉴定等技术，构建集成化蛋白质组定量分析新系统；采用荧光标记、固相衍生、深紫外激光诱导荧光、量子点标记、细胞计数等技术，发展超高灵敏度的目标蛋白质群的定量分析新方法。 可行性分析：本项目设置的研究内容不仅是国家中长期规划纲要规定的研究任务，而且是目前国际蛋白质组学研究领域的前沿和热点问题。参加本项目的研究团队由在十五和十一期间国内从事蛋白质组分离鉴定新技术新方法研究的优势单位组成。不仅在蛋白质定性分析方面具有很好的基础，而且在规模化蛋白质定量分析方面研究水平处于国际前沿水平。因此，完全有能力在蛋白质组定量新方法和相关技术领域取得重大突破。 在样品处理和分离材料方面，
13、研制了新型亲水性人工抗体材料，在去除高丰度蛋白质的同时，避免了因非特异性吸附引起的低丰度蛋白质丢失，可将血清中鉴定的蛋白质数目提高30%以上（Chem. Comm., 2011, 47, 3969-3971; unpublished data）；制备了多种新型聚合物复合纳米材料，实现了低丰度蛋白质的富集效率达到3个数量级（Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3345-3349; Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 2646-2648; Anal. Chem., 2008, 80, 6758-6763），回收率达到80%以上（Anal.
14、 Chem., 2009, 81, 503-508; Chem.-Eur. J., 2009, 15, ; Chem.-Asian J., 2010, 5, 1185-1191)。在分离材料方面，研制了无机-有机杂化亲水整体材料，在改善蛋白质分离效率同时，提高了蛋白质的回收率（Anal. Chem., 2010, 82, 5447-5454）。此外，还通过溶胶-凝胶法发展了一系列以金属氧化物为基质的细粒径分离微球（Chem. Comm., 2009, 20, 2929-2931），显著改善了蛋白质的分离能力。 在蛋白质组相对和绝对定量新技术新方法方面，建立了金属-双功能试剂-生物质谱方法、18
15、O标记-双功能试剂-生物质谱法、氘代酸酐标记-生物质谱法以及同系物酸酐标记-两维凝胶电泳-生物质谱法等蛋白质相对定量新方法，并成功用于一氧化氮刺激的酵母蛋白质组变化研究、小鼠酒精脂肪肝蛋白质组研究，以及四氯化碳诱导肝损伤蛋白质组变化研究（Anal. Chem., 2006, 78, 6614-6621; Anal. Chem., 2007, 79, 7700-7707; Proteomics Clin. Appl., 2010, 4, 111）；将甲基化同位素标记技术与蛋白质分离技术相结合，提高了定量技术的整体通量，筛选出了501个在早期大肠癌和正常组织中差异表达的蛋白质（J. Proteom
16、e Res., 2010, 9, 4701-4709）；利用串联18O同位素标记进行人卵巢癌血清的糖蛋白质组定量研究，发现了56 个糖肽的糖基化程度发生了显著改变（J. Proteome Res., 2010, 9, 227-236）；建立了基于稳定同位素稀释-多反应检测质谱的目标蛋白质绝对定量和验证方法，并将所建方法用于肝癌病人血浆中玻璃粘连蛋白和簇集蛋白的绝对定量分析，其结果与文献报道结果一致相对标准偏差小于20（J. Proteome Res., 2010, 9, 3319-3327）。 在集成化蛋白质组分析平台方面，实现了蛋白质在线变性、还原、酶解、分离和鉴定的集成，将蛋白质组样品处理时间从离线的20 h缩短到在线的7 min（Anal. Chem., 20
